斑蝥素對COLO 205 結腸直腸癌細胞株生長抑制作用與抗癌分子機制之探討; Study of the cantharidin on anti-proliferation and anti-cancer molecular mechanisms in COLO 205 cells

全文

(1)中國醫藥大學藥學院藥學系碩士班. 中國醫藥大學藥學院藥學系碩士班碩士論文. 碩士論文斑蝥素對. 斑蝥素對 COLO 205 結腸直腸癌細胞株生長抑制作用與抗癌分子機制之探討. 5 0 2 O L O C. 結腸直腸癌細胞株生長抑制作用與抗癌分子機制之探討. Study of the cantharidin on anti-proliferation and anti-cancer molecular mechanisms in COLO 205 cells. 指導教授：. 蔡輝彥. 教. 授. 共同指導教授：. 陳玉芳陳鴻儀. 副教授助理教授. 柯世薇撰. 研究生：柯世薇 Shih-Wei Ko. 中華民國九十七年六月. 中華民國九十七年六月.

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(3) 中文摘要近 26 年來，癌症一直為十大死因之首，目前尚無良好的對策來治療癌症。結腸直腸癌是常見且致死的癌症，在美國是癌症致死居第二位，於台灣癌症十大死因居第三位。臨床治療上以外科手術、化學治療及放射線治療為主。但治療之效果與預後都不盡理想，因此研發有效且副作用小的的抗癌藥物為當務之急，利用藥物誘發癌細胞凋亡，此為生物體維持體內平衡的機制之一。且發生凋亡時並不會引起發炎反應，對人體副作用較小，因此誘發細胞凋亡是目前抗癌治療策略及抗癌藥物發展的重要方向。斑蝥素 (Cantharidin) 是斑蝥主要藥用成份，相關研究證實 Cantharidin 具有抗癌、免疫調節、抗菌與抗病毒等作用。本論文主要研究目的，在探討 Cantharidin 對結腸直腸癌細胞株 (COLO 205)生長抑制作用與抗癌機制。我們以倒立式相位差顯微鏡檢測細胞型態變化，顯示經 Cantharidin 處理後細胞數有變少及皺縮的情形，且有似凋亡小體產生。以 MTT 方法檢測細胞存活率，實驗結果顯示 COLO 205 細胞經 Cantharidin 處理後，細胞存活率呈現劑量與時間依存性的抑制，其 IC50 為 20.53μM。細胞週期分析顯示 Cantharidin 誘導 COLO 205 細胞停滯於 G2/M 期後，進而誘導細胞凋亡。以西方點墨法與 CDK1 活性檢測結果顯示，Cantharidin 會降低 cyclin B，CDK1 蛋白質的表現和活性，並促使 ChkI 及 p21 等蛋白質量增加。利用 TUNEL、DAPI 及 Annexin-V 染色及流式細胞儀檢測結果顯示有細胞凋亡的現象。檢測細胞粒線體膜電位及超氧自由基，顯示粒線體膜電位降低及超氧自由基(ROS)增加，以西方點墨法及 caspase I.

(4) 活性檢測顯示 cytochrome c、Fas、Bax 和 Bad 表現量增加，Bcl-2 蛋白質表現量降低，caspase-3、-8 及-9 活性增加，以 Real time PCR 檢測 AIF、Caspase-3、-8 及-9 mRNA 量有明顯增加。綜合以上結果，我們推論 Cantharidin 具有抑制細胞週期進行與活化粒腺體路徑和死亡受體接受體路徑而誘導細胞凋亡。. II.

(5) Abstract The past 26 years, the cancer has been the first of ten major causes of the death all the time, and good countermeasure does not treat the cancer yet. Colorectal cancer (CRC) is a common and lethal malignant disease, it’s the second most frequent cause of cancer-related death in the United States and occupy the third place in ten major causes of the death of the cancer in Taiwan. Surgical resection、chemotherapy and radiotherapy is the major treatment modality for CRC, but therapeutical effect and prognosis are not perfect. Therefore, investigate an effective and fewer side effect anticancer druge is the task of top priority. Apoptosis is one of the organism maintains the balanced and will not cause inflammation, it has fewer side effect for humen body. Therefore the most important strategy of chemotherapy is utilize medicine to induce cancer cell apoptosis. Cantharidin is the extract of the blister beetle, Mylabris, has been demonstrated to possess antitumor、Immune adjustment、antibiotic and antivirus effect. This thesis main research purpose to probe into that cantharidin can inhibit grow and anticancer mechanism for colorectal cell line (COLO 205). We use the microscope detects the change of cell type and showing that COLO 205 cell line deal with cantharidin, reduce the cell number、 shrink and look like has apoptosome. The MTT assay show that COLO 205 cell line deal with cantharidin, cell survival rate show a dose- and time-dependent manner, IC50 is 20.53μM. Cell cycle analyze show cantharidin induced COLO 205 cell line that cell cycle arrest at G2/M phase then induce apoptosis. Western blot and CDK1 activity show cantharidin can reduce cyclin B and CDK1 activity, and can promote III.

(6) chk1 and p21. The TUNEL、DAPI and annexin-v assay is to display the apoptosis of cantharidin on COLO 205. The MMP and ROS assay show reduce the mitochondria membrane potential. and increase reactive oxygen. species. Western blot and caspase activity assay demonstrate that cytochrome c、Bax、Bad and Fas are increase, Bcl-2 is decrease,and promote caspase-3、-8 and -9 activity. Comprehensive the above result, cantharidin can inhibited cell cycle and activity mitochodria/stress pathway、death receptor pathway then induced cell apoptosis.. IV.

(7) 致謝辭. 回首這三年的研究生涯心中所想的唯有兩個字，就是感謝。首先感謝中國醫藥大學藥學院蔡輝彥院長指導研究，蔡教授學識極為豐富，跨越臨床及基礎研究，感謝蔡教授不嫌棄，願意擔任指導教授，同時亦感謝中藥所陳玉芳所長協助及提攜，並常主動關心、指導為我設想，使我獲益良多。本實驗之所以能順利進行，須感謝楊家欣助理教授、黃雯雯助理教授及實驗室所有學長、學弟、學妹們的協助。分子生物學是我之前未曾接觸過的學科，在楊老師及黃老師的指導才一窺分生的奧妙，但短時間的學習，僅懂一點點皮毛而已，非常感謝楊老師及黃老師接受我這門外漢且熱心指導。實驗的學習及進行要感謝實驗室一起奮鬥的啟誠學長、羿霖、長霖學弟、家珺、若華、妤菁學妹及其他大學部的學弟妹們，感謝大家的幫助、關心，讓實驗室就像個小家庭一樣。還有一起學習的同學麗蟬、懷慶、建傑、弘偉、于菁、慈雲、鳳樟、碧純及孟宜等互相支持鼓勵。另外還要感謝陳鴻儀老師及成大神外李宜堅教授，帶領我進入學術研究的殿堂，和同學宜靜、學弟凱文及成大實驗室的助理學弟妹們的支持。最關心我的父母及弟妹，真的很愛您們。因為您們的愛及支持，讓我在生活上、學業上得到許多支持無後顧之憂，讓我全力以赴。接著我要感謝秀傳醫療體系總裁黃明和總裁及高專謝調楊先生 (前藥局主任)推薦，使我有這機會進入研究所研讀。同時也感謝藥局主任林孟嬌小姐及各組長們的支持，還有同事們的配合，讓我有較多的時間到學校做實驗，真的很感謝他們的犧牲假日及配合來成就我的夢想，當然最感謝的是美月小姐的鼓勵及幫忙，讓我真的開始行動實踐自己的夢想。. V.

(8) 一路走來深深感覺到，成就一件事，背後有多少人的配合、支持與幫助，真的非常感恩大家，願大家身體健康，心想事成。. 2008 年學生柯世薇謹誌. VI.

(9) 縮寫略字表 AIF. Apoptosis Inducing Factor. Apaf-1. Apoptosis activating factor-1. APS. Ammonium persulfate. Bcl-2. B cell lymphoma protein 2. Caspase. Cysteine asparate protease. CDK2. Cyclin-Dependent Kinase 2. CKI. Cyclin dependent kinase inhibitor. DAPI. 4',6-diamidino-2-phenylindole. DCFDA. 2’7’-dichlorodihydroflurescein diacetate. DMSO. Dimethyl sulfoxide. DNA-PK. DNA –dependent protein kinase. D.D.Water. Double Deionized Water. DioC6. 3,3’-Dihexyloxacarbocyanine iodide. DMEM. Dulbecco's Modified Eagle's Medium. DTT. Dithiothreitol. ECL. Enhanced chemiluminescence. EDTA. Ethylenediaminetetraacetic acid. ELISA. Enzyme-linked immunosorbent assay. Endo-G. Endonuclease G. FACS. Fluorescence Activated Cell Sorting. FBS. Fetal Bovine Serum. HIF-1. Transcription factor Hypoxia-Inducible Factor 1. H2DCFDA. 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate. Indo-1-AM. [1-[2-amino-5(4-carboxylindol-2-yl)-phenoxy]-2-(2’a mino-5-methylphenoxy)ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid. L-G. L-glutamate VII.

(10) LMA. Low-meliting gel. MDM2. Murine double minute 2. MMP（Δψm） Mitochondrial membrane potential MMPS. Matrix metalloproteinases. NAC. N-acetyl cysteine. NF-κB(p65). Nuclear factor-kappa B. NMA. Normal melting point agarose. PS. Penicillin / Streptomycin. PI. Propidium Iodide. PBS. Phosphate Buffered Saline. PPP. Phosphoprotein phosphatase. PPM. Mg2+-dependent PPases. PVDF. Polyvinylidene Difluoride. ROS. Reactive Oxygen Species. SDS-PAGE. Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis. VIII.

(11) 總目錄中文摘要. ………………………………………………………. I. 英文摘要. ………………………………………………………. II. 誌謝辭. ………………………………………………………. V. 縮寫字表. ……………………………………………………… VII. 總目錄. ………………………………………………………. 表目錄. ……………………………………………………… XII. 圖目錄. ……………………………………………………… XIII. IX. 第一章總論……………………………………………………………1 第一節緒言……………………………………………………………1 第二節研究背景………………………………………………………3 第三節人類結腸直腸癌介紹…………………………………………9 第四節細胞週期………………………………………………………24 第五節細胞凋亡. ……………………………………………………32. 第六節研究目的………………………………………………………42 第二章研究方法………………………………………………………44 第一節研究材料與儀器………………………………………………44 一、細胞株 ………………………………………………………44 二、藥品試劑 ……………………………………………………46 三、設備與器材 …………………………………………………49 第二節研究方法………………………………………………………50 一、配製藥物……………………………………………………50 二、細胞培養……………………………………………………50 三、利用倒立式相位差顯微鏡檢測細胞型態…………………54 四、細胞存活率分析—MTT ASSAY ………………………… 54 IX.

(12) 五、流式細胞儀分析………………………………………………55 1. 細胞週期及 sub-G1 的影響 …………………………………55 2. Annexin-V 分析……………………………………………… 57 3. 檢測細胞內粒線體膜電位的變化 ………………………… 58 4. 活性氧化物（Reactive oxygen species, ROS）產生之檢測…59 5.. Caspase-3,- 8,- 9 活性分析………………………………… 60. 六、細胞內分子螢光染色—TUNEL/DAPI 螢光染色法…………61 1.. TUNEL (Terminal deoxynucltidetransferase dUTP Nick End Labeling) / DAPI （4-6-diamidine-2-phenyl indole）染色…61. 七、 CDK1/Cdc2 之活性分析 …………………………………… 62 八、即時定量聚合酵素連鎖反應（Real-time Polymerase Chain Reaction）（Real-time PCR） …………………………………62 九、西方墨點法 ……………………………………………………65 第三節統計方法………………………………………………………69 第三章研究結果………………………………………………………70 第一節 Cantharidin 對人類結腸直腸癌細胞（colo 205）細胞型態的影響………………………………………………………………70 第二節探討 Canthaeridin 對人類結腸直腸癌細胞存活率的影響……………………………………………………………… 71 第三節探討 Cantharidin 對人類結腸直腸癌細胞之細胞週期 G2//M 與 Sub-G1 及相關蛋白質的影響 ……………………………… 72 第四節探討 Cantharidin 對人類結腸直腸癌細胞誘導細胞凋亡的影響………………………………………………………………74 一、 Annexin-V 染色……………………………………………74 二、 TUNEL/DAPI 染色檢測細胞凋亡 …………………………74. X.

(13) 第五節. Cantharidin 誘導人類結腸直腸癌細胞的細胞凋亡之路徑探討 …………………………………………………. 76. 一、探討 Cantharidin 對人類結腸直腸癌細胞粒線體膜電位之影響 ………………………………………………. 76. 二、探討 Cantharidin 對人類結腸直腸癌細胞產生活性氧物質（ROS）之影響…………………………………… 第六節. 77. 探討 Cantharidin 對人類結腸直腸癌細胞其細胞凋亡路徑相關蛋白表現之變化 ……………………………. 79. 第四章. 討論 ……………………………………………………. 103. 第五章. 結論 ……………………………………………………. 109. 第六章. 參考文獻 ………………………………………………. 110. XI.

(14) 表目錄表一. 常見斑蝥素類製劑的臨床應用………………………………5. 表二. 自然界的 Serine/Threonine Protein Phosphatase 抑制劑……7. 表三. 96 年台灣省癌症十大死因……………………………………12. 表四. 結腸直腸癌之美國癌症協會, 修正之 Astler-Coller (MAC), Duke's 及 TNM 分級系統與五年存活率……………………15. 表五. 結腸直腸癌治療藥物辭彙表…………………………………23. 表六. 偵測凋亡細胞的方法…………………………………………35. 表七. Bcl 家族蛋白分類及功能…………………………………… 38. 表八. COLO 205 特性……………………………………………… 45. XII.

(15) 圖目錄. 圖一. 斑蝥素化學結構式……………………………………………3. 圖二. 同源的 Ser/thr protein phosphatases………………………… 8. 圖三. 大腸直腸癌形成過程由正常粘膜經一系列致癌及抑癌基因變化累積演變而成 …………………………………………… 10. 圖四. 結腸直腸癌與年齡發生率調查，統計於 1988 - 1992 年，含括所有種族之男性與女性 ……………………………………14. 圖五. 細胞週期 …………………………………………………… 26. 圖六. 細胞週期的調節 …………………………………………… 29. 圖七. 細胞 G2/M 期之調控機制……………………………………31. 圖八. 細胞凋亡—程式性死亡………………………………………34. 圖九. ICE 家族成員………………………………………………… 40. 圖十. 實驗流程圖……………………………………………………43. 圖十一細胞計數盤意示圖…………………………………………53 圖十二黃色的 MTT 經由活的細胞的粒線體變為紫色的 formazan ………………………………………………… 54 圖十三進行流式細胞計數儀分析出來的細胞週期標準圖………56 圖十四 Annexin-V 的作用示意圖 …………………………………57 圖十五 Cantharidin 對 COLO 205 細胞 24 及 48 小時的形態變化。 ……………………………………………………… 81 圖十六 Cantharidin 對 COLO 205 細胞存活率之影響……………82 圖十七 Cantharidin 對 COLO 205 細胞存活率抑制之影響………83 圖十八 Cantharidin 對 COLO 205 細胞存活率抑制之影響………84 圖十九 Cantharidin 對細胞週期之影響…………………………… 85 XIII.

(16) 圖二十 Cantharidin 對 COLO 205 細胞之細胞週期影響 ……… 86 圖二十一. Cantharidin 對 COLO 205 細胞之 G2/M 期相關蛋白質表現量與活性影響 ……………………………………… 87. 圖二十二. Cantharidin 對 COLO 205 細胞之 G2/M 期相關蛋白質表現量與活性影響 ……………………………………… 88. 圖二十三. Cantharidin 對 COLO 205 細胞之 G2/M 期相關蛋白質表現量與活性影響 ……………………………………… 89. 圖二十四. Cantharidin 對 COLO 205 細胞膜之 phosphatidylserine 外翻的影響 …………………………………………… 90. 圖二十五. Cantharidin 誘導 COLO 205 細胞 DNA 斷裂之情形 …91. 圖二十六. Cantharidin 對 COLO 205 細胞粒線體膜電位的影響…92. 圖二十七. Cantharidin 對 COLO 205 細胞粒線體膜電位 (MMP) 百分比 …………………………………………………… 93. 圖二十八. Cantharidin 對 COLO 205 細胞粒線體活性氧化物(ROS) 的影響 ………………………………………………… 94. 圖二十九. Cantharidin 對 COLO 205 細胞粒線體活性氧化物 (ROS) 增加百分比 …………………………………………… 95. 圖三十. Cantharidin 對 COLO 205 細胞之 cytochrome c 蛋白質表現量的影響 ……………………………………………96. 圖三十一. Cantharidin 及 NAS 對 COLO 205 細胞粒線體活性氧化物 (ROS)的影響……………………………………………97. 圖三十二. Cantharidin 及 NAS 對 COLO 205 細胞存活率的影響 98. 圖三十三. Caspase 活性檢測分析 ……………………………… 99. 圖三十四. Cantharidin 誘導 Fas 蛋白質之變化 …………… ……100. 圖三十五. Cantharidin 誘導 Bcl-2 蛋白質家族之變化……………101 XIV.

(17) 利用 Real-Time PCR 評估 AIF、Caspase-3、-8、-9 mRNA 變化 ……………………………………………………102 圖三十七 CTD 對 COLO 205 誘導細胞凋亡分子路徑示意圖…108 圖三十六. XV.

(18) 第一章總論第一節緒言自民國七十一年起至今，癌症躍居國人十大死因之首，佔全部死亡人數的 28.9%。在癌症中結腸直腸癌是常見及致命的疾病，佔癌症死因第三位，且死亡人數有逐年增加的趨勢。目前結腸直腸癌的治療仍以手術切除為主，而化療用藥所產生的副作用多且療效有限。病人在治療期間免疫功能差容易感染、生理機能失調等。因此若能研發出可提升患者的生活品質，增加存活率，低副作用，亦能對於癌症的治療效果與化療藥物有相同作用的天然中草藥時，是癌症醫學治療的一大福音。斑蝥為中國傳統藥用動物。在國內外的研究中發現，斑蝥素具有抗癌、免疫調節、毛髮生長刺激劑、抑制革蘭氏菌生長、抗病毒與治療傳染性疣等作用。藥理的研究證實 Cantharidin 具有抑制 Protein Phosphatase 1 與 Protein Phosphatase 2 的酵素活性。根據文獻上的報告，Cantharidin 對人類 CCRE-CEM 與 U937 血癌細胞株具有誘導細胞凋亡 (apoptosis) 的作用是經由 p38 與 JNK 等 Kinase 的活化(1, 2)，為 p53-dependent 的機制。 Cantharidin 對人類 Hep-3B 肝癌細胞株具有抑制細胞週期停止於 G2/M 期，並誘導細胞凋亡 (apoptosis)(3)。然而 Cantharidin 對其他癌細胞如結腸直腸癌細胞是否也具有相同的抗癌作用及相同的抗癌機制，到目前仍未清楚。所以本實驗希望找出能誘導癌細胞凋亡，且對人體低副作用的有效藥物。所選用藥物為中國傳統用藥，利用先人的智慧，在前人已用 1.

(19) 來治療腫瘤的藥物，是否對其他癌症有相同療效及其可能的抗癌機制。希望能發現及發展成有效且低副作用的抗癌藥物，期望能降低癌症導致人類死亡的比率，提升人類的生活品質，免於不治之症之威脅，希望藉由此研究帶給人類更進一步的福祉。. 2.

(20) 第二節研究背景一、斑蝥素(Cantharidin)理化特性 1.藥名：斑蝥素（Cantharidin） 2. 化學名： exo , exo-2,3-dimethyl-7-oxobicyclo [2 ,2 ,1 ] heptane-2 ,3-dicarboxylic acid anhydr-ide(4) 3.分子量：196.20 4.結構式(圖一)：. 圖一斑蝥素化學結構式 5.分子式：C10H12O4 6.來源：節肢動物門，昆蟲綱，芫青科（Meloidae）昆蟲，南方大斑蝥 Mylabris phalerata Pallas 或黃黑小斑蝥 Mylabris cichorii L.的乾燥蟲體。 8.物理、化學性質：無臭無色斜方形鱗狀晶體(5)，熔點為 218℃。不溶於冷水，溶於熱水、DMSO(10mg/ml)，難溶於丙酮、氯仿、乙醚及醋酸乙酯。. 3.

(21) 二、斑蝥素 (Cantharidin)作用斑蝥 (mylabris)出自〈神農本草經〉，作為藥用為莞青科的南方大斑蝥(Mylabris phalerate Pallas)和黃黑小斑蝥 (M. cichori Linnaeus)兩類的乾燥蟲體，其有效成分為斑蝥素 (Cantharidin，C10H12O4)，為皮膚潰爛發泡的毒劑，對腸胃道、泌尿道與腎臟等黏膜組織有強烈刺激性。歷代醫書如本草綱目、中藥大辭典中有治療腫瘤的描述(6)。在西方國家主要為皮膚科外用治療疣、軟疣等皮膚病(7)。在中國傳統藥物中使用已有二千年的歷史。辛、熱、有大毒，歸肝、胃、腎經，主治破血消腫, 攻毒蝕瘡, 發皰冷炙，用於癥瘕癌腫、積年頑癬、瘰瀝、贅疣、癰疽不潰、惡瘡死肌(8)，民間用藥於夏、秋二季捕捉，悶死或燙死，去頭、足、翅，曬乾生用火與糯米同炒至黃黑，去米，研磨用(9-11)。外用適量，研末或浸酒醋，或製油膏塗敷患處 , 不宜大面積用，可治療神經性皮炎、顏面神經麻痺、斑禿、傳染性疣、頭痛、過敏性鼻炎，內服治療肝炎、肝癌等(12-14)(表一)，目前中國大陸方面已具實際應用於臨床治療癌症的經驗(14)。國內外的研究中發現，Cantharidin具有抗癌作用(15)對子宮頸癌、鼻咽癌、皮膚癌、骨髓瘤、白血病、卵巢癌及肝癌細胞等具抑制作用和免疫調節(16)，此外亦可作為毛髮生長刺激劑(15)、抑制革蘭氏菌生長 (17). 、抗病毒與治療傳染性疣(18)等作用，其特色為刺激骨髓，使白血球. 升高(19, 20)。. 4.

(22) 表一. 常見斑蝥素類製劑的臨床應用. 藥物. 商品名. 適應症. 斑蝥素糖衣錠. 莞菁素. 原發性肝癌、乳癌等. 甲基斑蝥胺針劑. 肝康靈. 對原發性肝癌有一定療效. NCTD. 依康. 肝癌、食道癌、胃癌、賁門癌及白血球低下症. 斑蝥酸納注射劑羥基斑蝥胺. 奇寧注射液原發性肝癌、胃癌、肺癌、鼻咽癌原發性肝癌、胃癌、肺癌、結腸癌. 5.

(23) 藥理研究證實 Cantharidin 為 Protein Phosphatase 1 (PP1)及 PP2A抑制劑，對PP1、PP2A、PP4和PP5有較強的抑制性，以PP2A選擇性最高，對PP2B有微弱的抑制 (表二)。近幾年PP1及PP2A抑制劑，為抗癌藥研發的新目標(15, 16)。 Protein Phosphatase 在所有生物學中為主要的調節機制， PP1 及 PP2A 屬 Serine/threonine protein phosphatase 中的PPP family(圖二). (17). ，在許多訊息傳導路徑中扮演. 著重要的調節角色，如細胞週期的運行、細胞生長控制、分化、細胞骨架動力(cytoskeleton dynamics)、調節訊號傳導、細胞移動、Glucose 的代謝、鈣離子的運輸與細胞凋亡 (18) ，也是重要的腫瘤抑制蛋白 (tumor-suppressor protein)(19)。根據文獻上的研究報告，Cantharidin 對人類CCRE-CEM與 U937 血癌細胞株具有誘導細胞凋亡 (apoptosis) 的作用，是經由 p53-依賴型的機制，且主要是由 p38與JNK等 Kinase的活化(1, 2)，而誘導細胞凋亡。 Cantharidin 對人類Hep-3B肝癌細胞株具有抑制細胞週期停止於 G2/M期，並誘導細胞凋亡 (apoptosis)(3)。然而Cantharidin對其他癌細胞如結腸直腸癌細胞是否也具有相同的抗癌作用及相同的抗癌機制，到目前仍未清楚。. 6.

(24) 表二. 自然界的 Serine/Threonine Protein Phosphatase 抑制劑(20). **PP5 values were determined using native bovine PP5 and phosphohistone as a substrate. 7.

(25) 圖二同源的 Ser/thr protein phosphatases. 依據已知的蛋白質磷酸化酶的胺基酸序列所繪的系統樹. PP1-PP7 屬於一單一基因家族 (PPP) 結構上與 PP2C family (PPM)有區別. 位於虛線上方的磷酸酶為對 okadaic acid, cantharidin, microcystin and calyculin A 抑制有高度敏感性.. 8.

(26) 第三節人類結腸直腸癌介紹一、癌症成因「癌症」又叫 “惡性腫瘤”，源出於古希臘文。一般的細胞會相互平衡，其增生和死亡會有平衡點，而癌症是一群不正常的細胞，其生長脫離控制，因而快速生長以致影響生物體內其他正常的細胞組織造成症狀，且會隨著血液或淋巴系統擴散到身體的其他部位，也就是腫瘤轉移（metastasis），進而危害生命安全。癌症的發生是各種環境因素或是遺傳因素所衍生出來的。像是 1、化學物質:譬如煙焦油、二手煙可能引起肺癌，某些染料可能引起膀胱癌，亞硝胺可能引起肝癌等。經過長時間地和大量的致癌物質接觸誘發產生癌症。2、輻射線:如 X 光射線，核爆等。輻射線要達到相當大的量，才會觸發細胞產生變化。 3、其他:日光中的紫外線以及長期和高溫物質接觸，都可能和某些皮膚癌有關。長期的傷口潰瘍(如胃潰瘍、皮膚潰瘍等)，亦可能令附近的細胞發生變化，成為癌症。癌細胞是由正常細胞蛻變過來的，涉及細胞的基因突變，癌症的形成往往由數種致癌基因的活化或數種抑癌基因的功能喪失所累積而成的。從正常細胞到演變成癌細胞可能需要十多年，所以當檢查發現癌症時，通常已醞釀多時，且常已發生轉移了(世界衛生組織癌症顧問委員會)(圖三)。故對於高危險群的人，定期的癌症篩檢，是非常必要的。定期的健檢，可能可以找到癌前期病變，去除癌前期之病變，就可以避免癌症之發生。. 9.

(27) 家族多發性息肉症候群基因正常黏膜細胞. 高甲基化. K-ras 致癌基因活化. 增生息肉. 低度腺瘤. 轉移. 結腸直腸癌抑制轉移的基因缺失. 中度腺瘤. 高密度腺瘤. 抑癌基因 DCC 缺失. 抑癌基因 P53 缺失. 圖三大腸直腸癌形成過程由正常粘膜經一系列致癌及抑癌基因變化累積演變而成。. 10.

(28) 二、結腸直腸癌人類結腸直腸癌為一常見且致死的疾病，在美國是第三常見的惡性疾病和第二高的癌症相關致死疾病，僅次於肺癌(21)，2007 年在美國約有 154,000 新病例被診斷出有大腸癌，其中 112,000 為結腸癌，其餘為直腸癌，約有 52,000 死於大腸癌，約佔所有癌症死亡的 10%(22)。在全世界則是第四個常見的惡性疾病，每年約有 1,028,000 新病人及 529,000 死亡(21)。在台灣地區今年發布的統計資料(民國 96 年)(表三)，去年十大死因之首為惡性腫瘤，近 26 年來都沒改變，佔全部死亡人數 28.9%，比前年(95 年)增加 5.6%，較第二大死因心臟血管疾病死亡人數多 3 倍多。在惡性腫瘤中前三大死因為肺癌、肝癌、結腸直腸癌，以男、女分開統計，結腸直腸癌亦各據第三。去年一年因結腸直腸癌死亡人數有 4470 人，佔全部癌症死亡人數的 11.1%，與歐美以開發國家相近，比前年增加 3.9%，顯見因結腸直腸癌死亡人數有增加的趨勢(23)。. 11.

(29) 表三. 96 年台灣省癌症十大死因. 順位. 癌症死亡原因. 死亡人數. 每十萬人口死亡率死亡百分比%. 1. 肺癌. 7,993. 34.9. 19.8. 2. 肝癌. 7,809. 34.1. 19.4. 3. 結腸直腸癌. 4,470. 19.5. 11.1. 4. 女性乳癌. 1,552. 13.7. 3.9. 5. 胃癌. 2,474. 10.8. 6.1. 6. 口腔癌. 2,312. 10.1. 5.7. 7. 攝護腺癌. 1,003. 8.6. 2.5. 8. 子宮頸癌. 833. 7.4. 2.1. 9. 食道癌. 1,438. 6.3. 3.6. 10. 胰臟癌. 1,354. 5.9. 3.4. 12.

(30) 三、發生率年齡是結腸直腸癌主要的危險因數，40 歲以下的人很少被診斷出結腸直腸癌，40～50 歲間發生率開始增加，20 歲以下極少，若發生在年輕人身上，則需懷疑是否有家族性息肉症或已先有潰瘍性大腸炎存在。平均一生有 5%之機率會得到結腸直腸癌, 90%的病例發生在 50 歲以後(圖四)。從全世界來看，已開發國家如北美、澳洲和西及北歐的發生率較開發中國家如非洲和亞洲高，東方人較西方人少。地理位置的差異可歸因於飲食及暴露的環境不同。大腸的任何部位都可能發生癌症，但以直腸得到癌症的機會最高約佔 43%，其他依次是乙狀結腸 25%、升結腸 15%、降結腸 5%、橫結腸 3%。結腸直腸癌 95%為腺癌，1%為鱗狀細胞癌。依結腸直腸癌症不同分期法其 5 年存活率如表四。若患者在 Stage I 其五年存活率大於 90%，故早期發現早期治療，大部份有好的預後且可降低死亡率。. 13.

(31) 圖四結腸直腸癌與年齡發生率調查，統計於 1988-1992 年，含括所有種族之男性與女性 (24, 25)。. 14.

(32) 表四結腸直腸癌之美國癌症協會, 修正之 Astler-Coller (MAC), Duke's 及 TNM*分級系統與五年存活率 Stage. TNM. Five-Year. Classification. Survival. MAC** Ducke’s. % T1,N0,M0. I. T2,N0,M0. >90. A. A. B1. A. B2. B. IIA. T3,N0,M0. IIB. T4,N0,M0. IIIA. T1-2,N1,M0. 55-60. C1. IIIB. T3-4,N1,M0. 35-42. C2/3. IIIC. T(any),N2,M0. 25-27. C1/2/3. IV. T(any),N(any),M1. 5-7. C. 60-85. B3 C. D. Primary tumor (T) TX: Primary tumor cannot be assessed Tis: Carcinoma in situ T1: Tumor invades submucosa T2: Tumor invades muscularis propria T3: Tumor penetrates muscularis propria and invades subserosa T4: Tumor directly invades other organs or structures or perforates visceral peritoneum Nodal status (N) NX: Regional lymph nodes cannot be assessed N0: No metastases in regional lymph nodes N1: Metastases in one to three regional lymph nodes N2: Metastases in four or more regional lymph nodes Distant metastases (M) MX: Presence or absence of distant metastases cannot be. 15.

(33) determined M0: No distant metastases detected M1: Distant metastases detected * 資訊來自 Greene et al.(26) **A : 腫瘤細胞局限於腸黏膜。 B1: 腫瘤細胞局限於腸壁肌肉層內。 B2: 腫瘤細胞穿透腸壁肌肉層 但並未侵犯到周圍組織。 B3: 腫瘤細胞穿透腸壁肌肉層 且侵犯到周圍組織。 C1: 腫瘤細胞局限於腸壁肌肉層內且有局部淋巴結轉移。 C2: 腫瘤細胞穿透腸壁肌肉層 但未侵犯到周圍組織有局部淋巴結轉移。 C3: 腫瘤細胞穿透腸壁肌肉層 已侵犯到周圍組織有局部淋巴結轉移。使用許可 American Joint Committee on Cancer (AJCC), Chicago, Illinois.(21, 26). 16.

(34) 四、症狀初期少有症狀，可能僅有出血或腹痛，一般症狀：有肛門出血、大便習慣改變、便血、便秘、大便變細、裡急後重（解完大便仍想再解）、貧血及體重減輕。末期時或可摸到腹部腫塊及淋巴腺腫大。. 五、病因環境和遺傳基因都會影響發展成結腸直腸癌，雖然家族遺傳罹患率高於一般人，但主要罹病者以偶發型結腸直腸癌居多，佔 95%以上。 1. 飲食--對於高動物蛋白、脂肪及精緻食物消耗量多的民族，統計上的調查有較高的大腸息肉、憩室、盲腸炎及大腸癌的發生率。 2. 潰瘍性大腸炎(Ulcerative Colitis) 30 年後約有 50％的病人惡化成大腸癌，克隆氏病(Crohn's Disease)有 20 倍的機會比正常人容易得到大腸直腸癌。 3. 家族性息肉(Familial adenomatous polyposis (FAP))及遺傳的非息肉性結腸直腸癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer (HNPCC)) 年齡達到 40 歲時，約有 80％的病患惡化為大腸直腸癌，癌狀家族症候群 (Cancer Family Syndrom) 家屬（第一近親）罹患大腸癌死亡的機會高於一般人約 3.2 倍，但這兩個症狀也佔全部患者不到 5%(27-29)。. 17.

(35) 六、診斷潛血檢查、內視鏡檢查(Endoscopic Exam)及放射學檢查篩選有助於疾病早期診斷，但順從篩選指導原則的人仍是相對少數，大部份病人是在有症狀時才檢查出來。另外還有肛門指診，大腸Ｘ光檢查 (Barium Enema)，組織切片(Biopsy)及細胞鑑定(Cytology)，腫瘤記號蛋白(CEA)，電腦斷層，靜脈腎臟攝影，胸部 X 光照像，肝臟掃瞄，胸部超音波，血液尿液常規及血液生化檢驗等都是結腸直腸癌診斷所需做的檢查，有利於診斷及鑑別診斷。. 七、治療病理學上的分期提供重要的預後預測，也提供治療方法的選擇。腫瘤侵犯的組織深度和區域的淋巴結影響牽涉等，為主要的預後預測及分類系統。治療以手術切除為根本治療方式，放射線療法及化學療法可當輔助治療，以降低死亡率及復發率，對於轉移的患者可延長存活時間。 1. 外科手術--外科手術切除為主要治療方式，以切除原發腫瘤及區域淋巴結為目標，切除後五年存活率介於 20-50%之間 a. 治本的方法：作根本切除，即開刀時，把病變的腸子及淋巴腺、血管儘量切除乾淨，此法適用於 A、B 及 C 期之病人。 b. 治標的方法：因為Ｄ期之病人已有鄰近器官的轉移，或廣泛蔓延而無法作根部切除，僅考慮減少病人痛苦，延長其壽命，解決排便問題的姑息手術。在接受手術治療後，復發位置常見於局部、肝、肺、腹腔、腹腔. 18.

(36) 後淋巴腺，約有三分之一的患者合併有淋巴結轉移。同時具有病理形態分化不良及有淋巴結轉移之患者復發之機率很高，因此這兩種指標將助於決定哪一類的患者需接受手術後放射線或化學藥物治療。 2. 放射線療法--包含手術前、手術後，及手術中放射線治療對Ｃ期或Ｂ期的病人，手術後作會陰或骨盤腔治療，可消除手術所無法去除之病灶進而減少復發率。 a. 手術前估計無法切除之腫瘤，經放射性療法使之變為可切除，也可減少手術中癌細胞之擴散，即謂術前放射性療法。 b. 對於局部廣泛之直腸腫瘤患者，手術中放射治療可以加強體外放射治療之效果 c. 於無法切除的癌或轉移的癌，為減輕病人之疼痛或肛門出血，可作放射性治療。手術後放射線治療可以減少 MAC 分期（modified Astler-Coller stage）(表四) B2，B3 以及 C1-C3 期患者約 20%的復發機會。一般而言，術後放射線治療所引起之慢性副作用並不常見。接受 4500cGy 以下照射量之小腸因放射線引起之發炎，阻塞等腸道併發症十分少見。 3. 化學療法：用於Ｂ、Ｃ期手術後之輔助療法，或用於Ｄ期病人藉以延長生命和改善生活品質，其目的有三： a. 防止或延緩遠處癌之轉移。 b. 防止或延緩局部癌之再發。 c. 對無法切除之病人減輕其痛苦，包括整體情況的改善，體重的增加和症狀的減輕和痛得舒緩，延長其生命。一些前瞻性研究調查證明對於有轉移的患者使用化學療法相對於只用緩和性照護有較長的存活期且生活品質較好(30-33)。. 19.

(37) fluorouracil (5-FU)在過去 35 年仍然是大腸直腸癌化學治療的主幹，平均存活約 11-12 個月，現在平均存活時間中位數是以前的二倍，患者一般可生活超過兩年，這主要歸因於有新的有效的藥物加入醫療。目前治療藥物有五種 Fluoropyrimidines (一般合併使用 leucovorin, capecitabine), Irinotecan, Oxaliplatin, Cetuximab and panitumumab, bevacizumab (表五)。治療目標依患者個別情況而定，對大部份病人來說治療是為緩解症狀而不是治癒，治療藥物如下： I. Fluoropyrimidines： fluorouracil (5-FU，以下簡稱 5-FU) 為結腸直腸癌的主要治療藥物，為 fluorinated pyrimidine 抑制 thymidylate synthase 此為 pyrimidine nucleotide synthesis 的速率限制脢 (rate limiting enzyme)(34)，一般與 leucovorin 合用，此可使 fluorouracil 與 thymidylate synthase 的結合穩定因此提高抑制 DNA 的合成(35)。 Fluorouracil 的副作用與給藥方式有關，若以高劑量靜脈注射給藥，如每天打針連續 5 天每 4-5 星期一次，則嗜中性白血球減少和胃炎較常見。若每星期靜脈注射給藥則腹瀉較常見若是靜脈輸注則血液及胃腸道的毒性較少但常見 (”hand-foot syndrome”) palmar-plantar erythrodysesthesia(36-38) 。口服方式給藥則常見毒性為 hand-foot syndrome，其他不良反應為腹瀉、嘔吐、噁心和骨髓抑制等。在 Stage III 手術切除的患者，術後以 5-FU 靜脈注射或口服當輔助用藥，其效果相當(39, 40)，可使五年沒有腫瘤的再復發率從 42%增加到 58%，五年的整體存活率從 51%提升到 64%(41)。但在 Stage II 患者比較具爭議性，因不管有無使用輔助藥物治療，其五年存活率都約 80%(41)，所以不建議所有的 Stage II 患者常規的使用輔助藥物治療。美國 NCI 1990 年的大腸直腸癌輔助性的化學治療共識會議，就把 5-FU+ Levamisole 的化學治療當作是有淋巴腺轉移(Stage III)的大腸. 20.

(38) 癌的標準輔助性治療，在直腸癌方面，穿透腸壁但沒有淋巴腺轉移和有淋巴腺轉移的直腸癌，化學治療加上骨盆腔放射線治療，可使五年的疾病不復發比例由 37%提高到 59%。 II. Irinotecan— 為喜樹鹼的半合成衍生物，作用於抑制 topoisomerase-1，導致 DNA 無法複製，造成細胞死亡。其常見毒性為腹瀉、骨髓抑制、噁心、嘔吐和禿頭。 III. Oxaliplatin—是第三代的鉑金衍生物，與 DNA 形成巨大的錯化合物，使 DNA 合成和 RNA 的轉錄受抑制並誘發細胞凋亡，Oxaliplatin 與 5-FU 有很高的協同作用(42)。主要毒性為神經病變，特徵為末稍感覺異常，口部周圍與上呼吸消化道感覺異常，如在咽喉的痙攣性疼痛，但可自行恢復，另外還有手腳沒感覺或刺痛腹瀉等。 IV. Targeted therapies—在腫瘤組織上有些特殊分子構造，利用此特點研發特定的標靶，以利治療使用，主要目標是干擾細胞生長、存活和轉移，同時降低對其他正常細胞的毒性。目前可分成以下兩種： a. Epidermal growth factor receptor (EGFR) antagonists—目前代表藥物為 Cetuximab 和 Panitumumab 為將人、鼠的片段基因合成的單株抗體（monoclonal antibody），可專一性地與上皮細胞生長因子接受器（EGFR）結合，競爭性的抑制上皮生長因子的功能，而使得癌細胞不能進行複製、繁殖、血管無法再生，並誘發癌細胞凋亡。常見副作用中樞神經方面為不舒服 (Malaise)（49%）、發燒（33%）、頭痛（25%）；在皮膚方面為痤瘡樣紅疹（acneform rash； 90%，有 10%為嚴重型態），其他副作用如胃腸不適、噁心、嘔吐、呼吸困難、疲倦….等，輸注的過程當中，約有 3%的患者會發生嚴重的輸注反應，如急性呼吸道收縮、支氣管痙攣、蕁麻疹及低血壓等症狀。. 21.

(39) b. Angiogenesis inhibitors—目前已知癌細胞之血管新生現象，牽涉多種細胞激素之分泌，其中血管內皮細胞生長因子 ( vascular endothelial growth factor，簡稱 VEGF)為最主要之調控因子。因此，若能有效抑制癌細胞的血管新生，理論應可抑制癌細胞的生長，進而減少轉移發生的情況(43)。目前代表藥物為 Bevacizumab 是由美國 Genentech 公司所發展出來的新藥。它是將自老鼠身上所得對抗 VEGF 的單株抗體，利用基因工程的方式，將大部份的結構改造成人類蛋白質，將 Bevacizumab 注射到人體後，不會因為物種之不同而產生抗 Bevacizumab 之中和抗體。於 2004 年 2 月獲得美國食品藥品管理局(FDA)核准，合併使用以 Fluorouracil 為主之化學治療，第一線使用於治療轉移性大腸直腸癌病患。常見副作用為頭痛、噁心、嘔吐、厭食、口炎、便秘、上呼吸道感染、流鼻血、呼吸困難、蛋白尿等，嚴重之不良反應有高血壓危象、動脈血栓栓塞、腎病症候群、出血、胃腸道穿孔、傷口癒合困難、鬱血性心衰竭等。現今結腸直腸癌的治療仍是以外科手術切除為主，對於治療藥物雖有新藥加入治療行列，但至目前為止這些藥物仍有一定程度的毒性，這使我們想從中草藥中找尋有效且副作用小或無的最適治療藥物，在毒殺癌細胞時直接誘發細胞凋亡，以避免發炎反應發生或影響正常細胞。. 22.

(40) 表五. 結腸直腸癌治療藥物辭彙表*. FDA-approved drugs： Fluorouracil Capecitabine (Xeloda) Irinotecan (Camptosar) Oxaliplatin (Eloxatin) Cetuximab (Erbitux) Bevacizumab (Avastin) FDA-approved combination regimens： IFL: Irinotecan, bolus fluorouracil, and leucovorin — first-line therapy FOLFIRI: Irinotecan, infusional fluorouracil, and leucovorin — first-line therapy† FOLFOX: Oxaliplatin, infusional fluorouracil, and leucovorin — first- and second-line therapy Intravenous fluorouracil and bevacizumab — first-line therapy Cetuximab and irinotecan — therapy for EGFR-positive,‡ irinotecan-refractory disease. * FDA 為 Food and Drug Administration,. EGFR 為 epidermal growth factor receptor.. † FOLFIRI, 引述自 Douillard et al.,較常用 FDA 認可的另一個併用方式 infusional fluorouracil, leucovorin, and irinotecan. ‡ Immunohistochemistry testing is used to determine EGFR status.. 23.

(41) 第四節細胞週期一、細胞週期分期從親代細胞進行細胞分裂，分裂形成兩個子代細胞的過程，稱之為細胞週期（cell cycle）。簡單來說就是分裂細胞從有絲分裂結束到下次有絲分裂結束的過程。當中可分為三個時期：細胞生長期、DNA 複製期、細胞分裂期。細胞週期可分為五期 G0、G1、S 和 G2 (Interphase ) 及 M 期 (Mitosis)(44)(圖五)。 1、 G0 期：細胞可能經分化或複製完便處於靜止的狀態，可能是暫時休眠或者是永久的停止生長，需要有適當的訊息，才能使細胞進入細胞週期或分化 G1 期，亦稱休止期。 2、 G1 期：細胞開始生長，並產生 RNA 及蛋白質，細胞體積會增加，此期的染色體數目是 2N。而在進入 S (synthesis)期之前會檢查染色體 (chromosome) DNA 是否受到破壞以進行修補 (repair)的工作，以準備開始複製兩個子細胞，此時期需要花十到十二小時。為合成前期，亦稱分裂後期。 3、 S 期：細胞進行六到八小時 DNA 複製及合成，此時染色體數目介於 2N~4N 之間，為 DNA 合成期。 4、 G2 期：細胞進入 G2 期需要花三到四小時，染色體數為 4N。除了繼續生長並且合成蛋白質之外，在細胞要進入 M 期之前會負責檢查染色體 DNA 的複製是否完整，為進行有絲分裂 (mitosis)作準備，為分裂前期。. 24.

(42) 5、 M 期：此時期只有一小時。會停止細胞生長及蛋白質合成，開始進行分裂，為有絲分裂期。主要分為 4 個時期--前期、中期、後期、末期。前期：中心粒形成並一分為二，各向細胞的兩極移動，紡錘絲出現，複製的染色體濃縮，核膜消失。中期：染色體附著在紡錘絲上，並排列在細胞中央。後期：紡錘絲收縮，染色體互相分離並移向兩極。末期：紡錘絲消失，新的核膜形成，分別包圍分離後的染色體，中央部位的細胞膜內陷，形成兩個子細胞，新細胞在此期完成。在正常細胞週期的進行須受到精確的調控，才能維持細胞的數目及功能正常，所以在細胞週期的每個階段或時期交界都有所謂的『檢查點』（checkpoint），當 DNA 損害時，則細胞週期無法通過檢查點而造成停滯（arrest），此時會進行 DNA 修復，當修復完成時才得以進入下一個時期。G1 階段所監測為細胞的大小，在細胞成長過程中，細胞核遺傳物質若有受外界高能輻射線或化學物質的影響而突變，則啟動修復系統修復。S 階段則是進行 DNA 複製，G2 階段主要在檢查所有染色體 DNA 是否都被複製無誤且限複製一次，若一切都正常才能進入 M 階段細胞分裂。但若是遇到無法彌補的錯誤時，細胞則會走向計畫性凋亡（apoptosis）(45)。. 25.

(43) 圖五. 細胞週期(46). 26.

(44) 二、. 胞週期調控因數. 真核細胞的細胞週期中能使細胞正常規律的運行，維持一定的數量及功能，當中有個精密的調控系統在掌控。此調控系統由正向調節因子的依賴性蛋白激酶 CDKs （ Cyclin dependent kinases ）及週期蛋白（Cyclins）調控因子，與負向調節因子如 CKI。於 DNA damage、分化和老化時，負向調控細胞週期，而抑制細胞增生(47)。. 1、 CDKs （Cyclin dependent kinases）和 Cyclins (圖六). 在細胞調控中 Cyclin 是主要調控週期的蛋白，但需要 CDKs 來活化 Cyclin，由於單獨的 CDKs 是無法使下游分子形成磷酸化，故兩者需結合形成複合物才具有活性，進行細胞週期的運轉(44)。在 Cyclin 家族其成員已知有 20 種， Cyclin A~Cyclin T 。而 CDK 家族的有 9 種， CDK1~CDK9，但並非每一種 CDK 或 Cyclin 的性質與功能都清楚(48)。 CDK 為一系列 serine/threonine kinase，結構包含調節區與催化區，細胞週期中的各時期都會有特定的 Cyclin-CDK complex(49) ：G1 phase 為 Cyclin D1~3 與 CDK4/6 complex 及 Cyclin E-CDK2 complex、S 為 Cyclin A-CDK2 complex、G2/M phase 為 Cyclin B-CDK1 complex(50)。而 Cyclin H 與 CDK7 會形成一個具有酵素活性的複合物，可以活化 CDK1（Cdc2）與 CDK2(51)。. 27.

(45) 2、. CDKI （Cyclin dependent kinase inhibitors）. 細胞週期運行時藉由 CKI 的負向調控抑制 CDK 活性，以防不正常（1）INK family: 主要成員有 p14、p15(INK4B)、運轉，分成兩個家族(52)： p16(INK4A)、p18(INK4C)以及 p19(INK4D)，主要是競爭性抑制 Cyclin D （2）與 CDK4、CDK6 結合，而達 G1 期的控制使細胞無法進入 S 期(53)。 KIP/CIP. family: 主要成員有 p21(CIP1/WAF1/SDI1)、 p27(KIP1)以及. p57(KIP2)，其作用可同時調控抑制 Cyclin E/CDK2、Cyclin D/CDK1、 Cyclin D/CDK6 、 Cyclin A/CDK2 及 Cyclin B/CDK1 的活性，與 Cyclin-CDK 結合，形成 Cyclin-CDK-CDKI 的穩定形式，因此無法活化下游因子而抑制細胞週期(54, 55)。. 3、. p53、p21(圖六). p53 為轉錄因子(transcription factor)亦為抗癌基因。平時正常的 p53 會與 MDM2 結合形成不活化型態，當 DNA 受損時 p53 就會活化並且使產生的蛋白質量增加，其參與細胞修復、細胞週期停止及細胞凋亡等生物反應。受到活化的 p53 會使 p21 開始轉錄， p21 是 p53 的下游因子，可抑制 Cyclin-Cdk4 使細胞週期停滯在 G1/S 期並修復錯誤的 DNA 序列，若無法修復時則細胞會走向細胞凋亡(56)。另一方面，p21 具有抑制細胞增生的功能與抑癌基因的角色很相似，亦可使細胞週期停滯走向細胞凋亡，故 p21 在細胞凋亡上的研究值得探討(57)。. 28.

(46) POSITIVE REGULATORS. G0. Growth factors. Cyclin D CDK4 CDC25. G1b. G1a P16IN. M. Cyclin E. K4. CDK2. P27K1. NAGATIVE REGULATORS. P1. P21W AF1. P19. RB P53 P27K1. Cyclin B. P21. P107. DP1. P130. E2F. G1d. P1 W. AF1. CDC2. G2. S. Cyclin A. CyclinA. CDC2. CDK2. 圖六. 細胞週期的調節 71. 29. G1c.

(47) 4、 G2/M 期之機制 (圖七) 在細胞週期的研究發現，當細胞由 G2 要進入 M 期，Cdc2/CDK1 會藉由 Tyr-14 與 Tyr-15 的去磷酸化的修飾作用與 cyclin B 結合，使細胞進入 M 期(58)。正向調節 cyclin B/CDK1 活性的蛋白質包含去磷酸化的 Cde25c，而負向調節則包括 Cdc25c 的上遊 Chk1/2、14-3-3 與 Cdc2/CDK1 磷酸化的 Weel 與 Myt Kinase 等。此外，CDK 的抑制蛋白如 p21 和 p53 亦為負向調節者。研究發現許多讓細胞受到 DNA 損害如 γ-射線等，細胞週期會被抑制於 G2/M 期，此時 Cdc2/CDK1 的活性扮演著調節細胞凋亡的重要角色，如活化 Bcl-2 或 Caspase-9 的過度磷酸化，而使細胞進行凋亡。所以 Cdc2/CDK1 的活性對細胞週期的運行和調節細胞凋亡是非常重要(59)。. 30.

(48) Genotoxic Stress (i.e. IR or UV) ATM MDM2 MDM2 p19. ATR. p53. CHK2. p53. GADD45. CHK1 CHK2. p21. Cytoplasmic sequestration. Cdc25c. Cdc25 14-3-3. p. p. p. p. Cdc2. Cdc2. cyclin B Inactive G2 Arrest. 圖七. Myt1. Wee1. 細胞 G2/M 期之調控機制(60). 31. cyclin B Active Mitosis.

(49) 第五節. 細胞凋亡（Apoptosis）. 一、定義細胞凋亡又稱為生理上的細胞死亡 (Physiological cell death)或程式性死亡（programmed cell death；PCD）。最早由 Kerr 與 Wyllie 等學者在觀察細胞之生理形態所提出。當正常細胞受到傷害無法修復時，會自動引起細胞凋亡的機轉，使細胞自行死亡(61)。在多細胞有機生物體中，細胞凋亡是一種調節及維持細胞數及功能的重要程式。如果細胞凋亡程式被抑制或其中調控的基因有損傷，則會造成細胞無法走向計畫性死亡，導致細胞循著錯誤的訊息繁衍下去，造成細胞增生，癌化的表現。. 二、細胞凋亡特徵細胞凋亡(圖八)是初期常見的型態，包含著特定的生物反應變化。主要分為兩個時期（1）細胞凋亡早期：會出現細胞型態改變、細胞膜內層的 phosphatidylserine (PS)外翻(62)至膜外表層，(2)中期是細胞內的 DNA 會被核酸酶(endonuclease)裂解成不同倍數的 180~200bp 的片段 (DNA fragmentation)形成染色質濃集 (chromatin condensation)（3）晚期會出現細胞皺縮，而後細胞裂解為多個被細胞膜包覆的凋亡小體（apoptotic bodies），之後被吞噬細胞吞噬(63)，但無發炎反應發生(64)。因此認為誘導細胞進行細胞凋亡是一種較好的抗癌機制，可減少藥物所引發的併發症及副作用。. 32.

(50) 跟據細胞凋亡不同時期的特性，我們可以利用許多方法偵測凋亡細胞如表六。. 33.

(51) 圖八. 細胞凋亡—程式性死亡(65). 34.

(52) 表六細胞結構. 偵測凋亡細胞的方法細胞凋亡特徵. 測量法. Exposure of phosphatidylserine. Annexin-V binding. 細胞膜 (Plasma. Membrane blebbing. Microscopy. menbrane). Loss of integrity. PI Trypan blue. Loss of cytoplasmic volume. Microscopy. 細胞質. Degradation of cytoskeletal. Microscopy. (cytoplasm). protein. Western. Release of apoptotic proteins. Western. Rupture of outer membrane. Microscopy. Swelling of matrix. Microscopy. 粒線體 (Mitochondria). 細胞核. Release of apoptotic proteins. Western Microscopy. Loss of transmenbrane gradient. DiOC6，JC-1. Nuclear fragmentation. Microscopy. Chromatin condensation. Microscopy. DNA fragmentation. TUNEL Electrophoresis. (Nucleus) Release of apoptotic proteins. Western Microscopy. 35.

(53) 三、細胞凋亡的調控調控細胞凋亡的蛋白質可分為促進細胞凋亡(pro-apoptosis)、抑制細胞凋亡(anti-apoptosis)與執行細胞凋亡的蛋白質。細胞凋亡的路徑早期 (initiation)主要受細胞內或外訊息的刺激而啟動。作用期 (effector phase) 則受到促進及抑制細胞凋亡的蛋白質兩方調控，如 Bcl-2 家族蛋白質及 IAP 家族蛋白質等。分解期(degradation phase)則細胞受一系列活化的 caspase 等蛋白質執行細胞凋亡步驟(66)。細胞凋亡至少可以經由兩種方式將訊息傳遞至細胞核，傳遞路徑可分為內在及外在路徑，分別為粒線體傳遞路徑（Mitochondrial/stress pathway）、死亡受體路徑（death receptor pathway）(67)。. 1、內在路徑-粒線體路徑（Mitochondrial/stress pathway）當細胞受到細胞外或細胞內的壓力及傷害時，如放射性輻射、氧氣不足、藥物、DNA damage 等，會使細胞質的粒線體膜電位下降，促使 Cytochrome c，apoptosis-inducing factor (AIF)，及 Smac/DIABLO 等蛋白質從粒線體的 intermembrane space 釋放到細胞質中，與 Apaf-1 與 procaspase-9 結合形成 apoptosome，進而活化 Caspase-9 的複合物， Caspase-9 也促使下游的 caspase-3 活化，活化的 caspase-3 會切斷 DNA fragmentation factor45 (DFF45) / ICAD，最後誘導走向細胞凋亡(68)。. 36.

(54) 2、 Bcl-2 家族蛋白. Bcl-2 family 可分為促使凋亡蛋白分子（pro-apoptotic protein）及抑制凋亡蛋白分子（anti-apoptotic protein）兩類(69)(表七)。說明。這兩大類的蛋白結構類似，皆含有四個類似的 BH （Bcl-2 homology）(BH1~4)，彼此會形成同質二元體（homodimer）或異質二元體（heterodimer）結構來調控細胞凋亡(70)。抑制凋亡蛋白像是 Bcl-2 等，一般是在粒線體膜、核膜、內質網膜上，而促使凋亡蛋白 Bax、Bad、Bid 等則是在細胞質中。當受到凋亡訊號時就會轉位至粒線體膜上，影響粒線體膜電位的變化，造成膜的通透性改變(71)。像是細胞質的 pH 值上升或其他促凋亡蛋白影響時，Bax 可由細胞質轉移到粒線體膜上，而在膜上形成聚合體，進行傳遞凋亡訊號。而 Bad 受到凋亡訊息刺激時，則產生去磷酸化，移至粒線體上。以上作用會在粒線體上形成孔洞而促使讓粒線體膜內的蛋白，像是 Apaf-1、Cytochrome c、procaspase-9、procaspase-2、Smac/DIABLO 和 AIF (apoptosis-inducing factor)等釋放至細胞質，或造成粒線體膜電位下降，而產生大量氧化自由基(reactive oxygen species；ROS)，最後啟動 caspase 的活化因而產生凋亡(72, 73)。. 37.

(55) 表七 Bcl 家族蛋白分類及功能類別. 分類. 促使細胞凋亡蛋白分子. 抑制細胞凋亡蛋白分子. （pro-apoptotic protein）. （anti-apoptotic protein）. Bad、Bax、Bak、Bid、Bik、 Bcl-xL、Bcl-2、Bcl-w、Boo、 Bim、Blk、Bok、Bcl-Xs、. Mcl-1、A1/Bfl-1. Bcl-GL、Bcl-Gs、Bmf、Hrk、 Nip3、Nix、Noxa、MAP-1、 PUMA 功能. 過量表現時會促進細胞凋亡過量表現時會阻斷各種不同壓力所誘發的細胞凋亡. 38.

(56) 3、 Caspase (Cysteine dependent aspartate specific protease). Caspase 為一種有著 Cysteine 活化態殘基的蛋白酶，具有專一性。 Caspase 活化後可在標的蛋白 N 端的 aspartate 殘基與 C 端的 small hydrophobic residue 間切割(74)。未活化 caspase 有三個主要 domain： amino-terminal prodomain、large subunit （17-20 KDa）、small subunit （10-12 KDa）。這些未活化 caspase (precursor proenzyme)需要其他的 caspase 進行特定的蛋白分解作用，切割成大、小次單位，而形成四聚體模式，使這些 domain 形成活化態，另外 caspase 間具有自身催化或互相啟動的能力且有相似的催化部位(75)。未活化的 caspase 依作用分為（1）The ICE-1/Nedd-2 subfamily of apoptotic initiators：有 caspase -2、-8、-9、-10，可啟動活化 apoptotic executioners 以執行 apoptosis，稱為 promoter。（2）The Ced-3/CPP32 subfamily of apoptotic executioners：有 caspase:-3、-6 和-7，功能為執行細胞凋亡，裂解下游蛋白質。 (3)The ICE subfamily of cytokine processors：有 caspase-1、-4、-5、-11、-12、-13 和-14 主要與發炎反應有關(圖九)。細胞凋亡發生時，在粒線體路徑中會有特定訊息（Cytochrome c 釋出與 Apaf-1 結合）會傳遞給 Caspase-9 使其活化，接著再活化下游的 Caspase-3,-6,-7。造成膜蛋白分解及具修復 DNA 作用的 PARP 裂解，失去修復功能。另外也切除 ICAD (inhibitor of CAD)釋出 CAD 導致 DNA fragmentation，誘導走向細胞凋亡(76)。. 39.

(57) 圖九 ICE 家族成員 A：3 類 caspase：藍色參與發炎反應，紅色為執行者執行細胞凋亡，綠色為啟動者活化 apoptotic executuiners；B：caspase-3 的結構模型；C： caspase-3 的活化過程。(77). 40.

(58) 4、外在路徑-死亡受體路徑（death receptor pathway）. 由死亡接受器[Fas / CD95、TNFR1、TRAIL （TNF-related apoptosis inducing ligand）]與細胞膜上的表面接受體結合，將凋亡訊息傳遞至細胞內，釋放計畫性死亡訊號後會開啟細胞凋亡的受體。然後會活化 caspase cascade，經由 capsase 路徑所啟動的細胞凋亡是非常快速走向凋亡(78)。. 5、. Fas (CD95) / FasL Fas 是細胞表面的醣基蛋白，屬於腫瘤壞死因子（tumor necrosis. factor；TNF） receptor superfamily 中的第一型膜蛋白，分子量約 45 KDa。而 FasL (ligand)是第二型膜蛋白，分子量約 40 KDa。可維持細胞及 B 細胞的平衡，並有效清除有害的細胞（如發炎細胞）或其他癌化細胞。當 Fas 與 FasL 結合時會相互活化 Fas 接受器，並產生三聚化 (trimerization) 為活性的受體。接著促使下游的受體傳導蛋白質 Fas-associated death domain （FADD）和 procaspase-8 結合，進而活化 procaspase-8，具活性的 Caspase-8 經由一連串的過程會直接活化下游的 Caspase-3、-7 與 Capsase-6 最終促使細胞凋亡(79)。. 41.

(59) 第六節研究目的本研究目的為探討 Cantharidin 對人類大腸直腸癌細胞株（COLO 205 cell line）是否可抑制其細胞增生及誘導產生細胞凋亡的抗癌作用。另外並探討其抑癌細胞的分子機轉(圖十)。可分為下列階段：. 第一階段：探討 Cantharidin 對人類大腸直腸癌細胞(COLO 205)不同時間與濃度處理後，對其生長抑制之影響。 1. 利用倒立式相位差顯微鏡觀察，藥物對於細胞型態上的影響及增生抑制情況。 2. 利用 MTT assay 檢測藥物對於細胞存活率的影響。 3. 利用流式細胞儀分析藥物對細胞週期的影響。. 第二階段：探討 Cantharidin 造成細胞損傷及細胞凋亡相關因子。 1. 利用流式細胞儀觀察細胞傷害之相關因子，如活性氧化物、細胞粒線體膜電位的改變。 2. 利用 DAPI/TUNEL，Annexin-V 染色來檢測藥物對細胞破壞、損傷與細胞凋亡之影響。. 第三階段：探討 Cantharidin 誘導細胞凋亡之路徑。將經由處理過之細胞蛋白，以西方點墨法檢測凋亡路徑。. 42.

(60) Cantharidin. COLO 205 cell culture. Supress cell proliferation. Morphology. Phase-contrast microscope. Cell damage and apoptosis. Cell viability. Cell cycle. MTT assay. Flow cytometry CDK1/cdc2 activity Western blot. 圖十. DNA damage and apoptosis. Annexin-V, TUNEL, DAPI Mitochondria membrane potential ROS CASPASE activity REAL TIME PCR. 實驗流程圖. 43. apoptosis pathway. Western blot.

(61) 第二章研究方法第一節研究材料與儀器一、. 細胞株(表八). 本研究之實驗細胞株為人類之結腸腺癌細胞（ Human colon adenocarcinoma；COLO 205），由新竹食品工業研究所（Food Industry Research and Development Institute）菌種中心購得。. 44.

(62) 表八 COLO 205 特性 Name. COLO 205. Type. Human colo adenocarcinoma. Strain. Caucasian. Species. sapiens. (human). Ethnicity Gender. Homo. Male. Morphology epithelial. Age Stage. 70 years. Tissue. Colon;adenocarcino ma; from metastatic site: ascites. Incubation. 37°C. Incubation. Temp(°C). 5% CO2. Condition. Culture. 90% RPMI 1640 medium. Growth. mixed, adherent and. Medium. with 2mM L-glutamine. Property. suspension,grow. adjusted to contain 1.5 g/L. loosely attached and. sodium bicarbonate, 4.5 g/L. in suspension. glucose, 10mM HEPES, and 1.0 mM sodium pyruvate+ 10% heat-inactivated fetal bovine serum SubCulture. collect floating cells by. Freezed. 93%culture medium. Procedure. centrifugation; use. Medium. + 7% DMSO. trypsin-EDTA for attached cells Medium. every 2 to 3 days. Renew. 45.

(63) 二、. 藥品試劑 1. Dimethyl sulfoxide (DMSO): 購自 Sigma Chemical Co. 2. DMEM/F12 Medium:購自 GIBCO 3. Fetal Bovine serum (FBS; 胎牛血清):購自 GIBCO 4. L-glutamine (LG; 麩醯胺酸):購自 GIBCO 5. Penicillin-Streptomycin (PS):購自 GIBCO 6. Disodium hydrogen phosphate（Na2HPO4）:購自 Merck 7. Sodium chloride（NaCl）:購自 Merck 8. Potassium dihydrogen phosphate（KH2PO4）:購自 Merck 9. phiphiLux®-G1D2 kit：購自 OncoImmunin 10. Potassium chloride（KCl）:購自 Merck 11. Trypan Blue:購自 Sigma chemical Co. 12. Trypsin-EDTA:購自 Amersco 13. Triton X-100:購自 Sigma chemical Co. 14. Propidium iodide（PI）:購自 Sigma chemical Co. 15. RNase A（Ribonuclease A）:購自 Sigma chemical Co. 16. Ethanol:購自 TEDIA 17. Formaldehyde:購自 Merck 18. 5X TBE buffer:購自 Amresco 19. Agarose I:購自 Amresco 20. 10X Blue Juice (Gel loading buffer):購自 Invitrogen 21. 核酸純化試劑組（DNA purification kit）：購自 Gene Mark 46.

(64) 22. ROS 螢光染劑(2’,7’- Dichlorodihydrofluorescein diacetate, H2DCFDA) 23. MMP 螢光染劑（3’,3’-Dihexyloxacarbocyanine iodide, DioC6）：購自 Molecular Probes 24. Calcium 螢光染劑（Indo-1-AM）：購自 Molecular Probes 25. CaspaLux®9-M1D2 kit：購自 OncoImmunin 26. CaspaLux®8-M1D2 kit：購自 OncoImmunin 27. Bovine serum albumin (BSA):購自 Merck 28. Acrylamide/Bis 40% solution (ACRYL/BISTM 29:1):購自 Amresco 29. APS (Ammonium persulfate):購自 Amresco 30. Protein assay-Dye reagent concentrate:購自 Bio-Rad 31. 10X SDS buffer (Sodium dodecyl sulfate):購自 Amresco 32. TEMED (N,N,N’,N’-Tetramethyl-ethylenediamine):購自 Amresco 33. Tris (Tris(hydroxymethly)-aminomethane):購自 Amresco 34. Glycine:購自 Amresco 35. Methanol:購自 TEDIA 36. Protein maker:購自 Upstate 37. Tween 20:購自 Amresco 38. ECL kit (Enhanced chemiluminescent kit):購自 Amersham 39. 顯影劑:購自 Kodak 40. 定影劑:購自 Kodak 41. BioMax Flim:購自 Kodak. 47.

(65) 42. 蛋白質萃取試劑 (PRO-PREP protein extraction solution):購自 iNtRON Biotechnology,INC 43. 10X SDS-PAGE running buffer (TG-SDS buffer): 購自 Amresco 44. 5X Protein loading dye:購自 Amresco 45. BCA protein assay reagent:購自 Pierce 46. Butylated hydroxytoluene(BHT):購自 Sigma 47. 一級抗體： (1) Anti β-actin：購自 sigma (1:5000) (2) Anti-Cdk1/Cdc2：購自 oncogene (1:750) (3) Anti-Cdk2：購自 upstate (1:1000) (4) Anti-Cyclin A：購自 upstate (1:250) (5) Anti-Cyclin B1：購自 upstate (1:1000) (6) Anti-p21waf1：購自 Calbiochem (1:1000) (7) Anti-Bcl-2：購自 BD (1:500) (8) Anti-Bid：購自 Chemicon (1:500) (9) Anti-Bax：購自 Calbiochem (1:100) (10) Anti-Fas：購自 BD (1:5000) (11) Anti-Cytochrome c：購自 BD (1:1000) (12) Anti-Chk1：購自 BD (1:250) 48. 二級抗體 (a) goat anti-mouse IgG (HRP) horseradish peroxidase conjugated antibody:購自 Chemicon (b) goat anti-rabbit IgG (HRP) horseradish 48.

(66) peroxidase conjugated antibody: 購自 Chemicon (c) goat anti-goat IgG (HRP) horseradish peroxidase conjugated antibody: 購自 Chemicon 三、設備與器材. 1. 細胞培養箱:購自 Nuaire 2. 細胞培養盤:購自 FALCON 3. 細胞培養皿:購自 FALCON 4. 無菌操作臺:購自 Lian Shen 5. 細胞計數器 (Haemocytometer)：購自 Boeco 6. 冷凍管：購自 TPP 7. 倒立式位相差顯微鏡 (phase-contrast microscope):購自 Zeiss 8. 冷凍離心機：購自 Appendorf 9. 冷凍高速離心機：購自 HERMLE 10. 微量天平 (TE-200)：購自 MILLTER 11. 去離子水製造機 : 購自 Millipore 12. 流式細胞儀 (Flow cytometry)：購自 Becton Dickinson 13. Dispensor:購自 TPP 14. DNA 電泳槽：購自 Mupid-2 15. 酸鹼值測定計 (C831)：購自 Consort 16. 微量離心管：購自 Orange 17. Pipetment:購自 Costar 18. PVDF membrane:購自 Millipore 19. SDS-PAGE 電泳槽套組：購自 Bio-Rad 49.

(67) 20. Mini-3D Shaker：購自 Boeco 21. Transfer Cell Blot 套組：購自 Bio-Rad 22. 加熱器：購自 Lab-Line 23. 分光光度計：購自 Beckman 24. 光學顯微鏡：購自 Nikon LABOPHOT-2 25. 酵素免疫分析儀（anthos2020）：購自 Anthors Labtec, Australia 26. 乾浴槽（Model 110001）:購自 Boekel 27. 雷射掃描共軛焦分光光譜顯微鏡：購自進階生物科技股份有限公司。. 第二節研究方法一、. 配製藥物 Cantharidin 以 DMSO 為溶劑配製庫存液（stock solution）儲存. 於-20℃冷凍庫中，溶液濃度為 5 mM。進行實驗操作時，細胞培養液固定毫升數，再依所須實驗藥物濃度，計算所須吸取 stock solution 毫升數。. 二、. 細胞培養. 1. 配製細胞培養液（ RPMI MEDIUM-1640）. 培養人類大腸直腸癌細胞株（COLO 205）所使用的培養液為 50.

(68) RPMI MEDIUM-1640，另要再添加胎牛血清（FBS）、抗生素（Penicillin and Streptomycin）、麩胺酸（L-glutamine），因此培養液最終含有 10% FBS、100 μ/ml Penicillin and Streptomycin 及 1% L-Glutamine。細胞依實驗需要培養於 10 公分細胞培養皿、24-well 與 96-well 細胞培養皿及 75T 與 25T 細胞培養瓶中，並置於 37℃、5% CO2、濕度 95%的無菌培養箱中培養。細胞以 trypan blue 染色，用血球計數盤計算活細胞數目及存活率，並控制繼代的細胞數在 2-5 × 105 cells/ml。. 2. 細胞解凍. 冷凍細胞之活化過程須把握快速解凍的原則，以避免重新結冰的冰晶和濃度過高之 DMSO 造成對細胞的傷害，導致細胞死亡。首先將新鮮的細胞培養液放入 37 ℃水浴鍋中，讓培養液回溫至 37 ℃，接著將溫好的培養液 10 mL 加至滅菌的 15 mL 離心管中，再從液態氮中取出冷凍管，迅速的將冷凍管移至 37 ℃水浴鍋中，盡量在 1-2 分鐘內融化，使冷凍管裡的細胞液急速解凍，融化至冰塊將解凍尚有些許小冰塊的狀態，在無菌操作檯中，再將冷凍管裡的細胞液取至含有回溫好的新鮮培養液的離心管中。搖勻後，以 1500 rpm 的速度離心 5 分鐘，後去除上清液，拍散細胞，加入 1 ml 的培養液，將之吸出加入含有新鮮的培養液 10 mL 的培養瓶(75T)，接著移入 37 ℃、5﹪ CO2、濕度 95%的培養箱中培養，隔日更換新鮮的培養基。細胞活化後，約一星期後，或繼代一至二代，待其細胞生長或特性表現恢復正常﹙例如產生單株抗體或是其他蛋白質﹚才開始做實驗。. 51.