西方墨點法

1. 細胞總蛋白質的抽取⁽⁹³⁾

培養細胞之細胞數約 1×10⁷ cells。將人類大腸直腸細胞癌細 胞株（COLO 205）種於 75T 培養瓶中，培養 24 小時，給予 Cantharidin

（20 μM）至培養液中，分別培養 6 小時、12 小時、18 小時、24 小 時，分別以 trypin 處理，將細胞收集至離心管離心 1500 rpm、5 分鍾，

離心後去除上清液，加入適量1X PBS，將細胞收取下移至 1.5 ml 的 eppendorf tube，再離心一次，然後加入適量的 lysis buffer (pH 7.4 Tris-HCl 50 mM、EDTA 0.5 mM、EGTA 0.5 mM、5 μg/μuL Aprotinin 0.3% 2-Mercaptoethanol、0.2 mM PMSF、5 μg/μl Leupeptin、)，置於 -80℃冰箱放置 24 小時後，取出然後離心 12000 rpm、20 分鐘、4℃，

取所有上清液此為總蛋白質，接著用 100℃沸水煮 5~10 分鍾，即可 置於-20℃冰箱保存備用，待所有時間點收齊再進行下面實驗。

2. 蛋白質定量

a. 檢量線的製作

以Bradford 定量法，使用胎牛血清白蛋白(Bovine serum albumin;

BSA)做為蛋白質標準品，利用酵素免疫分析儀（ELISA reader）在 O.D. 570 nm 測定蛋白質標準品吸光平均值來做檢量線（standard

curve），以計算蛋白質濃度，並求出趨勢線方程式及 r²值。

先取 Bradford reagent 染劑適量備用。取適量已配製好的標準品

（BSA 1mg/ml）加等量的二次水調配最終濃度梯度為 1、0.5、0.25、

0.125、0.0625、0 mg/ml，各取 10 μl 加 100 μl Bradford reagent 混合均 勻，置於 96 well plate 中（二重複），靜置 5 分鐘後以 O.D. 570 nm 測 量吸光值，測得標準品之吸光平均值，以 O.D. value (Y) 對蛋白質濃 度μg/ml（X），求出趨勢線方程式 y=ax+b，r²值趨近於0.99。

b.樣品定量

將待測蛋白稀釋10 倍，取 10 μl 已配製好的待測蛋白質加 100 μl Bradford reagent 混和均勻，置於 96 well plate 中（二重複），靜置 5 分鐘後以O.D. 570 nm 測量吸光值，所測得的 O.D. value (Y)，帶入趨 勢線方程式y=ax+b，求出該待測蛋白的蛋白質濃度（μg/ml）。

3. SDS-PAGE 凝膠電泳

a.SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)電泳：

電泳法是利用外加電場，對溶液中的帶電分子造成影響而使這些 分子移動，進而分離不同分子量的蛋白質。先配製下層膠，然後注入 膠台，緩緩用二次水去除氣泡並壓平下層膠的上緣，靜置一段時間待

樣品槽梳子(comb)到未凝固的膠體中，避免氣泡產生。靜置一段時 間，上層膠凝固後。將鑄好的膠體放入電泳槽中，加入電泳緩衝液

（Running buffer），然後小心拔出樣品槽梳子。做好的膠體先以 110 V、預跑 20 分鐘。將抽取好的蛋白質先 denature 然後與 4 倍 protein loading dye 混合 (蛋白質濃度約為 30 μg/μl)。取 5 μl 分子量標準品 (maker)和配製好的蛋白(30 μg/μl)由左至右分別 loading 到槽中。以 90 V 開始電泳。

4. 轉漬（Transfer）

電泳結束後，取下膠片將其放在Gel transfer device 轉漬到 PVDF 膜上。然後取下PVDF 膜用 5%脫脂牛奶 blocking 1 小時。然後置換 一級抗體(溶於 5﹪脫脂牛奶 in 0.05﹪ Tween 20 in 1X PBS 中)，放在 4 ℃冰箱中 overnight。隔天取出 PVDF 膜後置於小盒中以 0.05﹪

Tween 20 in 1X PBS 清洗 5 分鐘共 3 次。加入二級抗體溶於 5﹪脫脂 牛奶in 0.05﹪ Tween 20 in 1X PBS 中，震盪 1 小時，再取出 PVDF 膜後以0.05﹪ Tween 20 in 1X PBS 於小盒中清洗 5 分鐘共 3 次，即 可入暗房壓片。

5. 壓片步驟：(暗房中進行)

將 ECL 試劑之混合液(每瓶各取適量等比例混合)均勻滴在 PVDF 膜上反應約一分鐘。壓片卡匣(Cassette)內先以投影片剪成兩半，再用 膠帶黏合成卡片形式，PVDF 膜正面朝上、marker 放左邊置於壓片卡 匣(Cassette)內。以 Hyperfilm 軟片(柯達)進行壓片，感光時間依 PVDF 膜上螢光亮度決定時間長短，約 5 秒至數小時不等。感光完成後放入 顯影劑進行顯影(時間依實際觀察決定)，再以清水沖洗 30 秒後放入 定影劑中，過30 秒後再以清水沖洗 30 秒，將底片晾乾，最後在掃描 到電腦中存檔，最後利用Gel-pro 軟體分析各蛋白質的表現量。