細胞凋亡

一、 定義

細胞凋亡又稱為生理上的細胞死亡 (Physiological cell death)或程式 性死亡 （programmed cell death；PCD）。最早由 Kerr 與 Wyllie 等學者 在觀察細胞之生理形態所提出。當正常細胞受到傷害無法修復時，會自 動引起細胞凋亡的機轉，使細胞自行死亡⁽⁶¹⁾。在多細胞有機生物體中，

細胞凋亡是一種調節及維持細胞數及功能的重要程式。如果細胞凋亡程 式被抑制或其中調控的基因有損傷，則會造成細胞無法走向計畫性死 亡，導致細胞循著錯誤的訊息繁衍下去，造成細胞增生，癌化的表現。

二、 細胞凋亡特徵

細胞凋亡(圖 八)是初期常見的型態，包含著特定的生物反應變化。

主要分為兩個時期（1）細胞凋亡早期：會出現細胞型態改變、細胞膜 內層的 phosphatidylserine (PS)外翻⁽⁶²⁾至膜外表層，(2)中期是細胞內的 DNA 會被核酸酶(endonuclease)裂解成不同倍數的 180~200bp 的片段 (DNA fragmentation)形成染色質濃集 (chromatin condensation)（3）晚期 會 出 現 細 胞 皺 縮 ， 而 後 細 胞 裂 解 為 多 個 被 細 胞 膜 包 覆 的 凋 亡 小 體

（apoptotic bodies），之後被吞噬細胞吞噬⁽⁶³⁾，但無發炎反應發生⁽⁶⁴⁾。因 此認為誘導細胞進行細胞凋亡是一種較好的抗癌機制，可減少藥物所引 發的併發症及副作用。

跟據細胞凋亡不同時期的特性，我們可以利用許多方法偵測凋亡細 胞如表 六。

圖 八 細胞凋亡—程式性死亡⁽⁶⁵⁾

表 六 偵測凋亡細胞的方法

細胞結構 細胞凋亡特徵 測量法

Exposure of phosphatidylserine Annexin-V binding Membrane blebbing Microscopy 細胞膜

(Plasma

menbrane) Loss of integrity PI Trypan blue Loss of cytoplasmic volume Microscopy

Degradation of cytoskeletal protein

Microscopy Western 細胞質

(cytoplasm)

Release of apoptotic proteins Western Rupture of outer membrane Microscopy

Swelling of matrix Microscopy Release of apoptotic proteins Western

Microscopy 粒線體

(Mitochondria)

Loss of transmenbrane gradient DiOC6，JC-1 Nuclear fragmentation Microscopy Chromatin condensation Microscopy

DNA fragmentation TUNEL Electrophoresis 細胞核

(Nucleus)

Release of apoptotic proteins Western Microscopy

三、 細胞凋亡的調控

調控細胞凋亡的蛋白質可分為促進細胞凋亡(pro-apoptosis)、抑制細 胞凋亡(anti-apoptosis)與執行細胞凋亡的蛋白質。細胞凋亡的路徑早期 (initiation)主要受細胞內或外訊息的刺激而啟動。作用期 (effector phase) 則受到促進及抑制細胞凋亡的蛋白質兩方調控，如 Bcl-2 家族蛋白質及 IAP 家族蛋白質等。分解期(degradation phase)則細胞受一系列活化的 caspase 等蛋白質執行細胞凋亡步驟⁽⁶⁶⁾。

細胞凋亡至少可以經由兩種方式將訊息傳遞至細胞核，傳遞路徑可 分為內在及外在路徑，分別為粒線體傳遞路徑（Mitochondrial/stress pathway）、死亡受體路徑（death receptor pathway）⁽⁶⁷⁾。

1、 內在路徑-粒線體路徑（Mitochondrial/stress pathway）

當細胞受到細胞外或細胞內的壓力及傷害時，如放射性輻射、氧氣不 足、藥物、DNA damage 等，會使細胞質的粒線體膜電位下降，促使 Cytochrome c，apoptosis-inducing factor (AIF)，及 Smac/DIABLO 等蛋白 質從粒線體的 intermembrane space 釋放到細胞質中，與 Apaf-1 與 procaspase-9 結合形成 apoptosome，進而活化 Caspase-9 的複合物，

Caspase-9 也促使下游的 caspase-3 活化，活化的 caspase-3 會切斷 DNA fragmentation factor45 (DFF45) / ICAD，最後誘導走向細胞凋亡⁽⁶⁸⁾。

2、 Bcl-2 家族蛋白

Bcl-2 family 可分為促使凋亡蛋白分子（pro-apoptotic protein）及抑 制凋亡蛋白分子（anti-apoptotic protein）兩類⁽⁶⁹⁾(表 七)。說明。這兩大 類的蛋白結構類似，皆含有四個類似的BH （Bcl-2 homology）(BH1~4)，

彼此會形成同質二元體（homodimer）或異質二元體（heterodimer）結 構來調控細胞凋亡⁽⁷⁰⁾。抑制凋亡蛋白像是Bcl-2 等，一般是在粒線體膜、

核膜、內質網膜上，而促使凋亡蛋白Bax、Bad、Bid 等則是在細胞質中。

當受到凋亡訊號時就會轉位至粒線體膜上，影響粒線體膜電位的變化，

造成膜的通透性改變⁽⁷¹⁾。像是細胞質的 pH 值上升或其他促凋亡蛋白影 響時，Bax 可由細胞質轉移到粒線體膜上，而在膜上形成聚合體，進行 傳遞凋亡訊號。而Bad 受到凋亡訊息刺激時，則產生去磷酸化，移至粒 線體上。以上作用會在粒線體上形成孔洞而促使讓粒線體膜內的蛋白，

像是Apaf-1、Cytochrome c、procaspase-9、procaspase-2、Smac/DIABLO 和 AIF (apoptosis-inducing factor)等釋放至細胞質，或造成粒線體膜電位 下降，而產生大量氧化自由基(reactive oxygen species；ROS)，最後啟動 caspase 的活化因而產生凋亡^{(72, 73)}。

表 七 Bcl 家族蛋白分類及功能 類別 促使細胞凋亡蛋白分子

（pro-apoptotic protein）

抑制細胞凋亡蛋白分子

（anti-apoptotic protein）

分類 Bad、Bax、Bak、Bid、Bik、

Bim、Blk、Bok、Bcl-Xs、

Bcl-GL、Bcl-Gs、Bmf、Hrk、

Nip3、Nix、Noxa、MAP-1、

PUMA

Bcl-xL、Bcl-2、Bcl-w、Boo、

Mcl-1、A1/Bfl-1

功能 過量表現時會促進細胞凋亡 過量表現時會阻斷各種不同壓 力所誘發的細胞凋亡

3、 Caspase (Cysteine dependent aspartate specific protease)

Caspase 為一種有著 Cysteine 活化態殘基的蛋白酶，具有專一性。

Caspase 活化後可在標的蛋白 N 端的 aspartate 殘基與 C 端的 small hydrophobic residue 間切割⁽⁷⁴⁾。未活化 caspase 有三個主要 domain：

amino-terminal prodomain、large subunit （17-20 KDa）、small subunit

（10-12 KDa）。這些未活化 caspase (precursor proenzyme)需要其他的 caspase 進行特定的蛋白分解作用，切割成大、小次單位，而形成四聚體 模式，使這些 domain 形成活化態，另外 caspase 間具有自身催化或互相 啟動的能力且有相似的催化部位⁽⁷⁵⁾。

未活化的 caspase 依作用分為（1）The ICE-1/Nedd-2 subfamily of apoptotic initiators：有 caspase -2、-8、-9、-10，可啟動活化 apoptotic executioners 以執行 apoptosis，稱為 promoter。（2）The Ced-3/CPP32 subfamily of apoptotic executioners：有 caspase:-3、-6 和-7，功能為執行 細 胞 凋 亡 ， 裂 解 下 游 蛋 白 質 。(3)The ICE subfamily of cytokine processors：有 caspase-1、-4、-5、-11、-12、-13 和-14 主要與發炎反應 有關(圖 九)。

細胞凋亡發生時，在粒線體路徑中會有特定訊息（Cytochrome c 釋 出與 Apaf-1 結合）會傳遞給 Caspase-9 使其活化，接著再活化下游的 Caspase-3,-6,-7。造成膜蛋白分解及具修復 DNA 作用的 PARP 裂解，失 去修復功能。另外也切除ICAD (inhibitor of CAD)釋出 CAD 導致 DNA fragmentation，誘導走向細胞凋亡⁽⁷⁶⁾。

圖 九 ICE 家族成員

A：3 類 caspase：藍色參與發炎反應，紅色為執行者執行細胞凋亡，綠 色為啟動者活化apoptotic executuiners；B：caspase-3 的結構模型；C：

caspase-3 的活化過程。⁽⁷⁷⁾

4、 外在路徑-死亡受體路徑（death receptor pathway）

由死亡接受器[Fas / CD95、TNFR1、TRAIL （TNF-related apoptosis inducing ligand）]與細胞膜上的表面接受體結合，將凋亡訊息傳遞至細 胞內，釋放計畫性死亡訊號後會開啟細胞凋亡的受體。然後會活化 caspase cascade，經由 capsase 路徑所啟動的細胞凋亡是非常快速走向凋 亡⁽⁷⁸⁾。

5、 Fas (CD95) / FasL

Fas 是細胞表面的醣基蛋白，屬於腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor；TNF） receptor superfamily 中的第一型膜蛋白，分子量約 45 KDa。而 FasL (ligand)是第二型膜蛋白，分子量約 40 KDa。可維持細胞 及 B 細胞的平衡，並有效清除有害的細胞（如發炎細胞）或其他癌化細 胞。當 Fas 與 FasL 結合時會相互活化 Fas 接受器，並產生三聚化 (trimerization) 為 活 性 的 受 體 。 接 著 促 使 下 游 的 受 體 傳 導 蛋 白 質 Fas-associated death domain （FADD）和 procaspase-8 結合，進而活化 procaspase-8，具活性的 Caspase-8 經由一連串的過程會直接活化下游的 Caspase-3、-7 與 Capsase-6 最終促使細胞凋亡⁽⁷⁹⁾。