第二章 研究方法
第一節 研究材料與儀器
3. 檢測細胞內粒線體膜電位的變化
DiOC6 (3-3’-dihexyloxacarbocyanine)為對粒線體具專一性之親脂 性陽離子螢光染劑，容易和帶有負電性之粒線體內膜結合，當粒線體受 刺激去極化而失去內膜之負電荷時，內膜被標定 DiOC6 會減少，因此 螢光強度也會降低，可作為偵測粒線體膜電位（MMP）之指標。在流式 細胞儀中可由488 nm 雷射激發出 525 nm 的螢光，以 FL1 之濾鏡偵測所 放出的螢光強度，藉以分析MMP。而粒線體的退極化（mitochondria membranes depolarization）伴隨早期的細胞凋亡發生，因此亦可做早期 凋亡偵測上的指標。
培養細胞之細胞數約 2×105/well，要有 1-2 個 well 做 blank。將人 類大腸直腸癌細胞株（COLO 205）種於 12 well 培養盤中，培養 24 小 時，給予 Catharidine 藥物，分別培養 3 小時、6 小時、12 小時後收集細 胞，PBS 清洗，離心後去除上清液，加入 MMP 試劑（10 μl DioC6/500 μl 之 1 倍的 PBS），量視細胞數多寡而定，混合均勻，Blank 只加等量 1X PBS，放入水浴鍋 37℃中，避光 30 分鐘，之後移置 FACS 管上流式細 胞儀分析。將 blank（斜線的 peak）調在 100~101之間，control (格線的 control)調在 101～102之間，樣品上機後，分析 MMP （peak 往右移代 表樣品的粒線體膜電位上升，表示藥物對粒線體沒影響。往左移代表粒 線體膜電位下降，導致細胞凋亡）。
4. 活性氧化物（Reactive oxygen species, ROS）產生之檢測(87)
2’,7’- Dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA)，為一種具 有螢光性質可通過細胞膜並具特異性追蹤評估細胞內產生 ROS 的多 寡，進行細胞染色。當H2DCF-DA 細胞內的乙醯脂酶（easterase）去乙 醯化（deacetylate）後會形成非螢光性的 DCFH，DCFH 會被細胞內的 H2O 氧化成具螢光性質的 DCF，並聚集在粒線體中，在流式細胞儀中可 由 488 nm 雷射激發出 355 nm 的螢光，藉以分析細胞內的 ROS 含量。
培養細胞之細胞數約 2×105/well，要有 1-2 個 well 做 blank。將人 類大腸直腸癌細胞株（COLO 205）種於 12 well 培養盤中，培養 24 小 時，給予Cantharidin (20 μM)，分別培養 3 小時、6 小時、12 小時後收 集細胞，1X PBS 清洗，離心後去上清液，加入 ROS 試劑（每支離心管 所需的量是 1 μl H2DCF-DA/500 μl 之 1X PBS）500 μl，混合均勻，Blank 只加等量1X PBS。放入水浴鍋 37℃中避光 30 分鐘，之後上流式細胞儀 分析。將 blank （斜線的 peak）調在 100~101之間，control (格線的 control) 調在101～102之間，樣品上機後，分析ROS （peak 往右移代表樣品的 ROS 增加，往左移則代表 ROS 被清除(抗氧化)）。
5. Caspase-3,-8,-9 活性分析(88)
PhiPhiLux 是利用設計一段可供 Caspase-3 及 Caspase-3-like 蛋白 辨識, 且能主動被細胞嗜入, loop 結構兩端標有螢光的 peptide,此段 peptide 稱為 PhiPhiLux。當此 PhiPhiLux 與受到刺激而產生凋亡現象的 細胞 (suspension / adherence ) 共同培養時, 會主動被這些已經 Induced Living Cell 大量噬入,由於此活細胞內部產生的 Caspase-3 結合到 PhiPhiLux 上的 GDEVDGI, 加上序列 PNP 的輔助, 造成 PhiPhiLux 結構上的斷裂, 使 Loop 結構兩端的螢光物質結合, 因而產生螢光。也 因此設計原理, PhiPhiLux 有放大活細胞內 Caspase-3 與 Caspase-3-like 的訊號放大的功能，另外偵測 Caspase-8,-9 活性亦以相同原理，但用 CaspaLux 染劑來偵測。之後用流式細胞儀以 488 nm 激發光,偵測定量與 定性，偵測到更早期、更完整、更準確的活細胞凋亡狀態。
培養細胞之細胞數約2×105/well。將人類大腸直腸癌細胞株（COLO 205）種於 12 well 培養盤中，培養 24 小時，給予 Cantharidin （20 μM）
藥物，收集細胞，離心到第二次，去上清液，避光加入染劑，每管加25 μl (10 μM substrate [Phiphilux for Caspase-3, CaspaLux L1D2 for Caspase-8 CaspaLux M1D2 for Caspase-9])，於 37℃中避光 60 分鐘。60 分鐘後，離 心 1500 rpm、5 分鐘，先把染劑倒掉，再用 1X PBS 把殘留染劑洗 1~2 次後，每管加入 500μl 之 1X PBS，並移至 FACS 管，之後上流式細胞 儀分析。Control (格線的 control)調在 101～102之間，樣品上機後，分析 Caspase-3,-8,-9 活性（peak 往右代表樣品的 Caspase-3,-8,-9 活性產生）。
六、 細胞內分子螢光染色—TUNEL/DAPI 螢光染色法
(89)1. TUNEL (Terminal deoxynucltidetransferase dUTP Nick End Labeling) / DAPI （4-6-diamidine-2-phenyl indole）染色
DNA 雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現缺口而產生的一系列 DNA 的 3’-OH 末端可在脫氧核糖核酸末端轉移脢（TdT）的作用下，將脫氧核 糖核酸和熒光素、過氧化物脢、堿性磷酸化脢或生物 Living beings 素形 成的衍生物 Living beings 標記到 DNA 的 3’-末端，從而可進行凋亡細 胞的檢測，這類方法一般稱為脫氧核糖核酸末端轉移脢介導的缺口末端 標記法（TUNEL）。DAPI 是一種核酸螢光染劑，會專一性的結合在 DNA 雙螺旋之小溝上的 AT 區，當細胞產生凋亡時會有染色質皺縮、DNA 片
Formaldehyde / 1X PBS，固定 15 分鐘，吸掉 3% Formaldehyde，用 1X PBS 洗二次，加入 0.1% Triton X-100 / in 1X PBS (1 ml)反應 15 分鐘，
再用1X PBS 洗二次，加入 In Situ Cell Death Detection Kit (TUNEL)中提 供的螢光染劑，在 37℃下避光反應 60 分鐘後用 1×PBS 清洗細胞三次，
再於避光環境加入加入 DAPI 染液 ( 1 μg/1 ml )約 300 μl，在 37℃避光 30 分鐘，吸掉染劑，用 1X PBS 洗三次，於倒立螢光顯微鏡 F = 200X
觀察細胞核與DNA 斷裂之變化並照相。 buffer、5μl ATP (1mM)與 5μl biotinylated MV peptide 當受質於 30℃反應 30 分鐘，再加入 200μl stop reagent 終止反應。然後離心(14,000 rpm，15 秒)，將 100μl 的上清液移至經處理的 96-well 之培養皿中，於 25℃中避 光反應 1 小時後，去上清液，以 1X PBS 清洗 5 次，再加入 100μl POD-streptavidin 於 25℃中避光反應 30 分鐘，以 1X PBS 清洗 5 次最後 加入POD substrate 於 25℃中避光反應 5 分鐘，用 ELISA reader 於波長 492 nm 下測吸光值。
八、 即時定量聚合酵素連鎖反應（Real-time Polymerase Chain Reaction）（Real-time PCR）
(91)係利用對雙股 DNA 具有特異性結合能力的螢光染料，加入 PCR 反應過程之中。利用螢光信號積累即時監測整個 PCR 反應過程，最後 利用過程中的螢光信號及反應循環次數的數據，以數學計算分析得知未 知標本的DNA 的起始含量。每個標本的 Ct 值與該標本的起始拷貝數的
對數存在線性關係，起始拷貝數越多，Ct 值越小。
利用Gene QuantⅡ (Pharmacia Biotech)測量 RNA 濃度及 A260/280 在 1.8~2.0 之間確保 RNA 的純度及品質。
biotin / dNTP mixture 和 1 μl klenow enzyme (Roche Applied Science, Mannheim, Germany)，混合均勻並放入 37℃水浴槽作用 20 小時。合成 好的探針須放在-20℃保存。
4. Real-time quantitative RT-PCR (qRT-PCR)的分析
利用LightCycler (Roche Applied science, Mannheim,
Germany) 進行 Real-time PCR，取 1μl 之 cDNA (約 50ng RNA)，加 1μl 之 LC Fast Start DNA Master SYBR Green Kit (Roche Applied Science, Mannheim, Germany) 及 3-4mM MgCl2 和 0.5mM 待偵測基因 primers，
最後體積為 10μl。 PCR 條件為 95℃，5 秒，Anneal 溫度依 primer 而 異，時間為5 秒，最後 72℃ (temperature ramp was 20 ℃ / sec)，8 秒，
進行45 cycles。擴增產物的專一性由 Melting curve 來判定。以 GAPDH gene 當作 internal control 來校正相對的 mRNA concentrations，為了要 保證實驗的準確性及再現性，在不同的時間點重覆實驗，Real-time PCR 之資料利用 LightCycler Software Version3.5 軟體內之 second derivative maximum method 來訂定 Ct，最後再用 ΔCt 方法來計算基因之表現量。
九、西方墨點法
1. 細胞總蛋白質的抽取(93)
培養細胞之細胞數約 1×107 cells。將人類大腸直腸細胞癌細 胞株（COLO 205）種於 75T 培養瓶中，培養 24 小時，給予 Cantharidin
（20 μM）至培養液中，分別培養 6 小時、12 小時、18 小時、24 小 時，分別以 trypin 處理，將細胞收集至離心管離心 1500 rpm、5 分鍾，
離心後去除上清液，加入適量1X PBS，將細胞收取下移至 1.5 ml 的 eppendorf tube，再離心一次，然後加入適量的 lysis buffer (pH 7.4 Tris-HCl 50 mM、EDTA 0.5 mM、EGTA 0.5 mM、5 μg/μuL Aprotinin 0.3% 2-Mercaptoethanol、0.2 mM PMSF、5 μg/μl Leupeptin、)，置於 -80℃冰箱放置 24 小時後，取出然後離心 12000 rpm、20 分鐘、4℃，
取所有上清液此為總蛋白質，接著用 100℃沸水煮 5~10 分鍾，即可 置於-20℃冰箱保存備用，待所有時間點收齊再進行下面實驗。
2. 蛋白質定量
a. 檢量線的製作
以Bradford 定量法，使用胎牛血清白蛋白(Bovine serum albumin;
BSA)做為蛋白質標準品，利用酵素免疫分析儀（ELISA reader）在 O.D. 570 nm 測定蛋白質標準品吸光平均值來做檢量線（standard
curve），以計算蛋白質濃度，並求出趨勢線方程式及 r2值。
先取 Bradford reagent 染劑適量備用。取適量已配製好的標準品
（BSA 1mg/ml）加等量的二次水調配最終濃度梯度為 1、0.5、0.25、
0.125、0.0625、0 mg/ml，各取 10 μl 加 100 μl Bradford reagent 混合均 勻，置於 96 well plate 中（二重複），靜置 5 分鐘後以 O.D. 570 nm 測 量吸光值，測得標準品之吸光平均值，以 O.D. value (Y) 對蛋白質濃 度μg/ml（X），求出趨勢線方程式 y=ax+b，r2值趨近於0.99。
b.樣品定量
將待測蛋白稀釋10 倍，取 10 μl 已配製好的待測蛋白質加 100 μl Bradford reagent 混和均勻，置於 96 well plate 中（二重複），靜置 5 分鐘後以O.D. 570 nm 測量吸光值，所測得的 O.D. value (Y)，帶入趨 勢線方程式y=ax+b，求出該待測蛋白的蛋白質濃度（μg/ml）。
3. SDS-PAGE 凝膠電泳
a.SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)電泳：
電泳法是利用外加電場，對溶液中的帶電分子造成影響而使這些 分子移動，進而分離不同分子量的蛋白質。先配製下層膠，然後注入 膠台，緩緩用二次水去除氣泡並壓平下層膠的上緣，靜置一段時間待
樣品槽梳子(comb)到未凝固的膠體中，避免氣泡產生。靜置一段時 間，上層膠凝固後。將鑄好的膠體放入電泳槽中，加入電泳緩衝液
（Running buffer），然後小心拔出樣品槽梳子。做好的膠體先以 110 V、預跑 20 分鐘。將抽取好的蛋白質先 denature 然後與 4 倍 protein loading dye 混合 (蛋白質濃度約為 30 μg/μl)。取 5 μl 分子量標準品 (maker)和配製好的蛋白(30 μg/μl)由左至右分別 loading 到槽中。以 90 V 開始電泳。
4. 轉漬（Transfer）
電泳結束後，取下膠片將其放在Gel transfer device 轉漬到 PVDF 膜上。然後取下PVDF 膜用 5%脫脂牛奶 blocking 1 小時。然後置換 一級抗體(溶於 5﹪脫脂牛奶 in 0.05﹪ Tween 20 in 1X PBS 中)，放在 4 ℃冰箱中 overnight。隔天取出 PVDF 膜後置於小盒中以 0.05﹪
Tween 20 in 1X PBS 清洗 5 分鐘共 3 次。加入二級抗體溶於 5﹪脫脂 牛奶in 0.05﹪ Tween 20 in 1X PBS 中，震盪 1 小時，再取出 PVDF 膜後以0.05﹪ Tween 20 in 1X PBS 於小盒中清洗 5 分鐘共 3 次，即 可入暗房壓片。
5. 壓片步驟：(暗房中進行)
將 ECL 試劑之混合液(每瓶各取適量等比例混合)均勻滴在 PVDF 膜上反應約一分鐘。壓片卡匣(Cassette)內先以投影片剪成兩半，再用 膠帶黏合成卡片形式，PVDF 膜正面朝上、marker 放左邊置於壓片卡 匣(Cassette)內。以 Hyperfilm 軟片(柯達)進行壓片，感光時間依 PVDF 膜上螢光亮度決定時間長短，約 5 秒至數小時不等。感光完成後放入 顯影劑進行顯影(時間依實際觀察決定)，再以清水沖洗 30 秒後放入 定影劑中，過30 秒後再以清水沖洗 30 秒，將底片晾乾，最後在掃描 到電腦中存檔，最後利用Gel-pro 軟體分析各蛋白質的表現量。
第三節 統計方法
實驗數據結果採用 SPSS 電腦統計套裝軟體中之變異數分析 (one-way-ANOVA)進行統計分析，以平均值標準差(mean ± SD)表示，
實驗組與對照組間之數據以 Student-t test 進行統計比較。當 p<0.05 表示具統計學上有差異意義，以”＊”代表。
第三章 研究結果
第 一 節 Cantharidin 對 人 類 結 腸 直 腸 癌 細 胞
（COLO 205）細胞型態的影響
COLO 205細胞給予濃度20μM Cantharidin各培養24、48小時後，
利用倒立式顯微鏡觀察細胞型態的變化（圖 十五）。結果可發現細胞 於第24小時，其細胞型態皺縮不規則化，且伴隨有凋亡小體的產生。
而在第48小時觀察發現皺縮不規則化狀況更加明顯，而且細胞質空泡 化、有凋亡小體的產生、細胞數目明顯減少。結果推論Cantharidin會 抑制COLO 205細胞增殖且有細胞凋亡的現象。
第二節 探討 Canthaeridin 對人類結腸直腸癌細胞存 活率的影響
將 人 類 結 腸 直 腸 癌 細 胞 株 (COLO 205 ） 加 入 不 同 濃 度 的 Cantharidin（濃度皆為 5、10、20、40 μM）。分別培養 24、48、72
將 人 類 結 腸 直 腸 癌 細 胞 株 (COLO 205 ） 加 入 不 同 濃 度 的 Cantharidin（濃度皆為 5、10、20、40 μM）。分別培養 24、48、72