討論

斑蝥是我國傳統用藥，斑蝥素(Cantharidin)是其主要藥用成份。

在國內外的研究中發現，Cantharidin具有抗癌作用⁽⁹⁴⁾，於1264年首先 應用於抗腫瘤治療，其特色是會刺激骨髓增加白血球數目⁽⁴⁾，但對黏 膜組織及腎臟和膀胱有刺激性，因而限制其臨床用途。臨床上⁽¹⁴⁾應用 於治療肝癌⁽⁹⁵⁾、B型肝炎、尖銳濕疣等⁽¹⁴⁾，對子宮頸癌、鼻咽癌、皮 膚癌、骨髓瘤、白血病、卵巢癌及肝癌細胞等具抑制作用和免疫調節

(96)。

斑蝥素為Protein phosphatases 1 (PP1)及2A 抑制劑，對PP1、PP2、

PP4和PP5有較強的抑制性，尤其是對PP2A選擇性最高，同時對PP2B 具微弱的抑制。近幾年PP1及PP2A抑制劑，為抗癌藥研發的新目標，

PP1和PP2A透過去磷酸化作用在許多訊息傳導路徑中扮演著重要的 調節角色，如細胞週期的運行、有絲分裂、細胞生長控制、分化、細 胞骨架動力(cytoskeleton dynamics)、調節訊號傳導、細胞移動、Glucose 的代謝、神經傳導、肌肉收縮、肝醣合成、鈣離子的運輸與細胞凋亡

(18)，也是重要的腫瘤抑制蛋白(tumor-suppressor protein)⁽¹⁹⁾ 等。抑制 PP1及PP2A會影響S期最終停滯於G2/M期進而產生細胞凋亡⁽¹⁶⁾。我們 在探討細胞週期及相關蛋白質的影響，經PI染色及流式細胞儀檢測，

發現Cantharidin會影響COLO 205細胞週期停滯在G2/M期，同時發現 有細胞凋亡的現象(圖 十九、圖 二十)。在細胞週期的研究發現 CDK1/cyclin B是主要影響細胞由G2期進入M期及調控細胞凋亡的主 要蛋白質之一⁽⁹⁷⁾，而其受Chk1、p21等蛋白質調控使CDK1/cyclin B 活 性改變而影響細胞分裂的進行^{(58, 98)}，以Western blot及CDK1活性試驗 觀察影響細胞週期的蛋白質變化，結果顯示CDK1及cyclin B在第6小 時先增加後明顯減少(圖 二十二)，其上游的調控蛋白Chk1及p21的蛋 白質表現量增加(圖 二十三)，因此認為Chk1及p21參與Cantharidin所 誘導的G2/M停滯的訊息傳遞調控。最近有許多研究證實CDK1活性的 改變可能導致細胞凋亡⁽⁹⁹⁾，我們的結果顯示CDK1的活性降低(圖 二 十三)，推論Cantharidin抑制CDK1的活性。

Cantharidin的作用，是在DNA複製後，延遲細胞週期而不影響 G1-S或S-G2，細胞週期的停滯是發生在中期之後，後期之前，干擾 染色體排列在中間，產生異常的紡錘體⁽¹⁰⁰⁾，同時開始進行細胞凋亡。

細胞凋亡亦受蛋白質磷酸化(protein phosphorylation)的調節，PP2A調 節磷酸化狀態及活化protooncogen產生Bcl-2，抑制PP2A會使Bcl-2過 度磷酸化而抑制活性，因而增強細胞凋亡過程。

國內外研究顯示，Cantharidin 對人類 CCRE-CEM 與 U937 血癌 細 胞 株 具 有 誘 導 細 胞 凋 亡 (apoptosis) 的 作 用 ， 且 是 經 由

p53-dependent 的機制，主要是由 p38 與 JNK 等 Kinase 的活化^{(1, 2)}。 Cantharidin 對肝癌細胞株(Hep 3B)及正常肝細胞(Chang)的 IC50分別 為2.2 及 30.2 μg/ml (36 小時)，使細胞週期停滯在 G2/M 期但不會抑 制其核酸生合成⁽¹⁰¹⁾，並誘導細胞凋亡 (apoptosis)⁽³⁾。對 Hela 使細胞 週期停滯於G2/M 期，且為時間依賴型，進而細胞凋亡(IC50為 3.2 μg /mL, 24HR)⁽¹⁰²⁾。我們從 MTT 分析可以發現 Cantharidin 造成的細胞毒 性具有藥物劑量及作用時間上的依存性（圖 十六、圖 十七、圖 十 八），具有抑制 COLO 205 細胞株之存活率，利用統計分析得 IC50為 20.53 μM (24 小時)，略高於前二種細胞但亦遠低於正常肝細胞(Chang) 的IC50。

細 胞 凋 亡 的 主 要 路 徑 分 為 粒 線 體 路 徑 及 死 亡 受 體 路 徑 ， 而 Caspase cascade 為傳遞死亡訊息的主要機制⁽⁶⁷⁾。Caspase-9、caspase-8 及 caspase-3 的活性明顯的比對照組高(圖 三十三)，且細胞質的 cytochrome c 蛋白質明顯的提高(圖 三十)，同時亦影響粒線體釋放 ROS 同時使粒線體膜電位下降(圖 二十八，二十六)，實驗亦證實 Cantharidin 係經由 ROS 的產生而致使細胞死亡(圖 二十九、三十 一、三十二)。

許多研究證實Bcl-2 family 具有調節粒線體傳遞的細胞凋亡，如 Bad 和 Bax 會 在 粒 線 體 外 膜 形 成 孔 洞 ， 致 使 通 透 性 改 變 而 使

cytochrome c 等釋放到細胞質及粒線體膜電位下降產生 ROS 增加^(72,

103)。釋放出的cytochrome c 會與 Apaf-1（apoptosis protease activing factor-1）結合活化 caspase-9，進一步活化 caspase-3。Cantharidin 誘 導細胞凋亡時，會降低抑制凋亡的Bcl-2 蛋白質量並提升促使凋亡的 Bax 及 Bad 蛋白質量(圖 三十五)，procaspase-3、-9 的蛋白質裂解(圖 三十)而 caspase-3、-9 的活性增加(圖 三十三)， 使 DNA 無法進行修 復而走向凋亡。同時觀察到粒線體的膜電位下降及ROS 量增加(圖 二 十六、圖 二十八)。

細胞凋亡的另一路徑為死亡受體路徑（death-receptor pathway）

又稱為外在路徑，Fas 是一種位於細胞表面的醣基化蛋白質，分子量 約42-52 KDa，屬於 TNF receptor superfamily 中 type I 膜蛋白，而 FasL 是屬於type II 膜蛋白。當 FasL 結合至 Fas 活化 Fas 受體，並吸引 FADD

（Fas- associated death domain；FADD）結合至受體位於細胞質中的 domain。接著會影響到 initiator caspase（caspase-8、caspase-10），使 procaspase-8 活化成具活性 caspase-8，此複合物稱為 death-inducing signaling complex（DISC）。由實驗結果發現COLO 205 經 Cantharidin 處理後會誘發 Fas 蛋白質表現量增加(圖 三十四)，進一步活化裂解 procaspase-8 使 caspase-8 活化促進 caspase-3 表現，而造成細胞凋亡

（圖 三十四）且 Cas-8 活性大於 Cas-9 活性。以 Real-time PCR 來檢

測Caspase-3、-8、-9 及 AIF 的 mRNA 的表現量，也都比對照組有明 顯的增加(圖 三十六)，因此可推論 Cantharidin 對 COLO 205 誘導細 胞凋亡主要是經由死亡受體路，徑並活化 Casepase cascades。同時亦 發現AIF mRNA 的表現量增加，可推論 Cantharidin 可能活化非粒線 體路徑而造成細胞凋亡。

綜合以上結果，我們將 Cantharidin 抑制 COLO 205 細胞存活之 機制如圖 三十七表示，證實 Cantharidin 使 COLO 205 細胞停滯在 G2/M 期並活化粒線體路徑及死亡受體路徑誘發 Caspase cascades 產 生細胞凋亡，具有抗癌的作用，因此認為 Cantharidin 可能是一個值 得開發且具潛力之抗癌藥物。

G2 M

Cyclin A/B CDK1

Cdc25c Chk1

p21 Caspase-8

Caspase-3

Bax

Bad Bcl-2

Cytochrome C Caspase-9

AIF

Cantharidin

Apoptosis

Fas (CD 95)

圖 三十七 CTD 對 COLO 205 誘導細胞凋亡分子路徑示意圖