第三章 研究結果
第四節 探討 Cantharidin 對人類結腸直腸癌細胞誘導細胞凋亡的影
一、 Annexin-V 染色
COLO 205 細胞給予濃度 20 μM Cantharidin 培養 24-48 小時後，利
用倒立式顯微鏡觀察細胞型態的變化，發現給藥處理後細胞形狀有皺 縮的現象，並伴隨有凋亡小體的產生。為要證明 Cantharidin 誘導 COLO 205 細 胞 凋 亡 ， 利 用 Annexin-V-FITC 檢 測 細 胞 膜 內 的 phosphotidylserine (PS)外翻到細胞膜外側表面的早期凋亡現象。在經 藥物處理 6-12 小時，發現 phosphotidylserine 被染色的凋亡族群比例 有明顯的增加，由23.65% (6 小時)增加到 44.22% (12 小時)(圖 二十 四)。 結果推論 COLO 205 有細胞凋亡早期現象。
二、 TUNEL/DAPI 染色檢測細胞凋亡
由 上 述 結 果 知 細 胞 有 早 期 細 胞 凋 亡 的 現 象 ， 因 此 利 用 TUNEL/DAPI 染色及倒立螢光顯微鏡觀察 DNA 斷裂及細胞核濃集現 象。COLO 205 細胞給予濃度 20 μM 的 Cantharidin 培養 24 小時後，
觀察螢光強度。在螢光顯微鏡下觀察，與對照組比較，經Cantharidint 處理過的細胞，可發現螢光強度有增加的現象，綠/白色螢光明顯比 控制組亮，結果顯示細胞核內染色質有凝聚與細胞核濃縮及DNA 斷 裂現象（圖 二十五）。
第五節 Cantharidin 誘導人類結腸直腸癌細胞的細胞 凋亡之路徑探討
一、 Cantharidin 對人類結腸直腸癌細胞粒線體膜電位之 影響
在細胞凋亡的過程中若是受粒線體途徑影響，則粒線體的膜電位 會下降或粒線體會產生大量氧化自由基(ROS)，同時粒線體會釋放 cytochrome c至細胞質中。因此利用DiOC6與DCFDA螢光染色，再以 流式細胞儀分析粒線體膜電位的改變與氧化自由基產生情形。 本實 驗以20 μM濃度之Cantharidin，投予COLO 205細胞培養3、6、12小時 後收集細胞，加入DiOC6染劑，利用流式細胞儀分析粒線體膜電位是 否改變。結果顯示隨著藥物處理時間越久，peak越往左移(圖 二十 六)，粒線體膜電位下降越多。藥物處理時間越久，粒線體膜電位下 降越明顯，在藥物處理3小時即與控制組(0小時)有統計上的差異 (p<0.05)，處理6-12小時亦有明顯差異(p<0.001)(圖 二十七)。結果顯 示cantharidin會影響COLO 205 細胞粒線體膜電位下降，顯示在細胞 凋亡過程中會受粒線體途徑影響。
二、 探討 Cantharidin 對人類結腸直腸癌細胞產生活性氧化 物（ROS）之影響
在產生活性氧化物方面，以20 μM 濃度之 Cantharidin，培養 3、
6、12 小時後收集細胞，以流式細胞儀檢測染有 H2DCF-DA 之 COLO 205 細胞，其 ROS 含量，結果發現隨著 Catharidin 處理時間越久，其 peak 越往右移，ROS 含量越高(圖 二十八)。在藥物處理 3 小時 ROS 即有明顯增多(圖 二十九)，與藥物接觸的時間越久，則 ROS 含量越 多。蒐集Cantharidin 處理 6-24 小時後的 COLO 205 細胞萃取蛋白質 經Wwatern blot 測試，其細胞質 cytochrome c 蛋白質量有顯著的增加 (圖 三十)。
另外COLO 205 分三組分別給與 Cantharidin、ROS 的抑制劑 NAS 及Cantharidin + NAS 處理 24 小時，再以流式細胞儀檢測，發現只用 Cantharine 處理的細胞 ROS 增加許多，而只用 NAS 處理其 ROS 的量 和對照組差不多，而Cantharidin + NAS 處理的細胞其 ROS 的量只有 上升一些，與Cantharidine 處理細胞的 ROS 量有明顯的差異(圖 三十 一)。
依 上 述 分 組 法 以 MTT assay 來 看 細 胞 存 活 率 可 發 現 只 用 Cantharidine 處理的細胞存活率下降許多，而只用 NAS 處理其細胞存
活率和對照組差不多，而Cantharidin + NAS 處理的細胞其存活率亦 和對照組差不多，與Cantharidine 處理的細胞其存活率有明顯的差異 (圖 三十二)。
綜合上述，cantharidin 會使 COLO 205 細胞的粒線體膜電位下 降、ROS 大量產生及細胞質 cytochrome c 蛋白質量增加，推論 Cantharidin 誘導 COLO 205 細胞凋亡可能與粒線體路徑有關。另外給 與 ROS 抑制劑後，發現 ROS 的量和細胞存活率較不受 Cantharidin 影響，由此可推論Cantharidin 影響細胞粒線體釋放 ROS 而導致細胞 死亡。