第三章 研究結果
第六節 探討 Cantharidin 對人類結腸直腸癌細胞其細胞凋亡
細胞凋亡有許多路徑，本研究中我們觀察到 Cantharidin 會誘導細 胞粒線體膜電位下降及ROS 增加，因此近一步以 Western blotting 分 析粒線體凋亡途徑相關蛋白表現。此外亦探討細胞死亡受體路徑相關 蛋白質表現，觀察其是否為影響細胞凋亡之原因。
COLO 205 細胞經 Cantharidin (20 μM)處理 6-24 小時，以 Western blot 觀察相關蛋白質表現，發現 cytochrome c 增加，Pro-caspase-9、
caspase-3 降 低 ( 圖 三 十 ) 。 Fas/CD95 蛋 白 質 表 現 量 增 加 而 Pro-caspase-8 則降低(圖 三十 四)。
近一步來看 Caspase-3,-8,-9 活性之分析，以 20 μM 之 Cantharidin，
投予COLO 205 細胞培養 24 小時後收集細胞，加入 PhiPhLux®-G1D2 染劑，利用流式細胞儀分析Caspase-3,-8,-9 活性測試。結果顯示(圖 三 十三），以 20 μM 濃度之 Cantharidin 處理 COLO 205 細胞經藥物處理 過的實驗組其 Caspase-8、Caspase-9 及 Caspase-3 的活性明顯的大於 對照組且有統計上的差異(p<0.001)(圖 三十三)且 Cas-8 的活性大於 Cas-9 的活性，以 Real Time PCR 來測定其細胞凋亡的基因表現，觀 察 AIF、Caspase-3、Caspase-8 及 Caspase-9 的 mRNA 的表現量，經
Cantharidin 處理過的 COLO 205 細胞，其 AIF、Caspase-3、Caspase-8 及 Caspase-9 的 mRNA 的表現量均高於對照組(圖 三十六)且有明顯 的差異。
而Bcl-2 家族蛋白質的變化，可發現 Bad 和 Bax 隨藥物處理越久 其蛋白質表現量增加，而 Bcl-2 蛋白質量減少(圖 三十五)因此推論 Bad、Bax 及 Bcl-2 參與 Cantharidin 誘導 COLO 205 細胞凋亡。
綜合以上結果我們推論Cantharidin 是透過死亡受體路徑、caspase 及Bcl-2 家族蛋白質、粒線體路徑及非經由上述兩種路徑，可能誘發 AIF 表現誘導細胞凋亡。
圖 十五 Cantharidin 對 COLO 205 細胞 24 及 48 小時的形態變化。
顯微觀察倍數200X。
圖 十六 Cantharidin 對 COLO 205 細胞存活率之影響。 COLO 205 經CTD 處理 24 至 72 小時， 以 MTT assay 檢測細胞存活率， 細 胞存活率以CTD 處理組與對照組於 570 nm 波長之吸光值百分比計 算，並以平均值±標準差來表示(取樣數目為不同三重覆實驗)。
0 20 40 60 80 100 120
0 5 10 20 40
% of inhibition
Concentration (μM)
圖 十七 Cantharidin 對 COLO 205 細胞存活率抑制之影響。 COLO 205 經 Cantharidin 5-40 μM 處理 24 小時， 以 MTT assay 檢測細胞存 活率，細胞存活率以 Cantharidin 處理組與對照組於 570 nm 波長之吸 光值百分比計算。
0 20 40 60 80 100 120
0 24 48 72 96
Time (h)
% of inhibitor
圖 十八 Cantharidin 對 COLO 205 細胞存活率抑制之影響。 COLO 205 經 Cantharidin (20 μM)處理 24 至 96 小時， 以 MTT assay 檢測 細胞存活率，細胞存活率以 Cantharidin 處理組與對照組於 570 nm 波 長之吸光值百分比計算。
圖 十九 Cantharidin 對細胞週期之影響。 Cantharidin 處理不同時間 之細胞週期變化， 以 PI 染色後經流式細胞儀分析。 Apo 為不成套 染色體的細胞族群(sub-G1)。 取樣數目為不同三重覆實驗。
圖 二十 Cantharidin 對 COLO 205 細胞之細胞週期影響。 COLO 205 於不同時間點經 Cantharidin 處理後， 以 PI 染色及流式細胞儀分 析細胞週期之變化。
圖 二十一 Cantharidin 對 COLO 205 細胞之 G2/M 期相關蛋白質表 現量與活性影響。 Cantharidin 對 COLO 205 細胞之 CDK1 活性的檢 測。
圖 二十二 Cantharidin 對 COLO 205 細胞之 G2/M 期相關蛋白質表 現量與活性影響。 以 Western blot 分析細胞內 Cyclin A、 Cyclin B 與CDK1 的表現 (β-actin 為 internal control)。
圖 二十三 Cantharidin 對 COLO 205 細胞之 G2/M 期相關蛋白質表 現量與活性影響。 以 Western blot 分析細胞內 Chk1 與 P21 的表現 (β-actin 為 internal control)。
圖 二十四 Cantharidin 對 COLO 205 細胞膜之 phosphatidylserine 外 翻的影響。COLO 205 細胞以 Cantharidin 處理 6-12 小時以後，以 Annexin-V-FITC 染色，並以流式細胞儀分析細胞膜上
phosphatidylserine 外翻之情形。
A
B
圖 二十五 Cantharidin 誘導 COLO 205 細胞 DNA 斷裂之情形。COLO 205 細胞以 Cantharidin 處理 24 小時後用 TUNEL/DAPI 雙染色，並以 螢光顯微鏡觀察細胞內DNA 斷裂與細胞核濃縮之情形，白色箭頭為 DNA 斷裂的凋亡細胞， 顯微觀察倍數 600X。
圖 二十六 Cantharidin 對 COLO 205 細胞粒線體膜電位的影響。
COLO 205 經 Cantharidin 處理 3-12 小時，以 DiOC6 染色，經流式細 胞儀分析粒線體膜電位改變。
圖 二十七 Cantharidin 對 COLO 205 細胞粒線體膜電位 (MMP) 百 分比。COLO 205 經 Cantharidin 處理 3-12 小時，以 DiOC6 染色，經 流式細胞儀分析，粒線體膜電位有明顯的下降。
圖 二十八 Cantharidin 對 COLO 205 細胞粒線體活性氧化物(ROS) 的影響。COLO 205 經 Cantharidin 處理 3-12 小時，以 DCFDA 染色，
經流式細胞儀分析粒線體ROS 之變化。
圖 二十九 Cantharidin 對 COLO 205 細胞粒線體活性氧化物 (ROS) 增加百分比。COLO 205 經 Cantharidin 處理 3-12 小時，以 DCFDA 染色，經流式細胞儀分析，粒線體ROS 明顯的增加。
圖 三十 Cantharidin 對 COLO 205 細胞之 cytochrome c 蛋白質表現 量的影響。 細胞經 Cantharidin 處理 6-24 小時，以 Western blot 分析 細胞內cytochrome c、procaspase-9 與 caspase-3 的表現 (β-actin 為 internal control)。
圖 三十一 Cantharidin 及 NAS 對 COLO 205 細胞粒線體活性氧化物 (ROS)的影響。COLO 205 分三組各經 CTD、NAC、CTD + NAC 處理 24 小時，以 DCFDA 染色，經流式細胞儀分析粒線體 ROS 的變化。
圖 三十二 Cantharidin 及 NAS 對 COLO 205 細胞存活率的影響。
COLO 205 分三組各經 CTD、NAC、CTD + NAC 處理 24 小時，以 PI 染色經流式細胞儀分析存活率影響。
圖 三十三 Caspase 活性檢測分析。Cantharidin 對 COLO 205 細胞 處理24 小時後 caspase-8、 caspase-9 與 caspase-3 活化態的變化。
圖 三十四 Cantharidin 誘導 Fas 蛋白質之變化。COLO 205 細胞經 Cantharidin 處理不同時間點以後以 Western blot 檢測 Fas、
pro-caspase-8 與 caspase-3 蛋白質之變化(β-actin 為 internal control)。
圖 三十五 Cantharidin 誘導 Bcl-2 蛋白質家族之變化。COLO 205 細 胞經Cantharidin 處理不同時間點以後以 Western blot 檢測 Bcl-2， Bad 與Bax 蛋白質之變化。
圖 三十六 利用 Real-Time PCR 評估 AIF、Caspase-3、-8、-9 mRNA 變化。以Real-Time PCR 評估 Cantharidin (20 μM)處理 COLO 205 細 胞株在第24 小時之 AIF、Caspase-3、-8、-9 實驗組和對照組的 mRNA 變化。