以接有OsSUT2
、
4 基因啟動子之 pGEM-T easy vector 做為模板，而 OsSUT1 以PCR 產物當作模板，設計帶有限制酵素切位之專一性引子: PSUT1-F1-SacI/PSUT1-R4-SmaI、PSUT2-F1- SacI/ PSUT2-R2-SmaI 與 PSUT4-F1-SacI/
PSUT4-R4-SmaI (表六)，進行 PCR 反應，分別合成長度為 1959 bp、830 bp 與 833 bp 之啟動子，再將這些啟動子利用 SacI 與 SmaI 切位接在不含 intron 之 β-glucuronidase (GUS)基因之前 (圖十九)，分別命名為
PSUT1-DF(-1968/-10)::GUS、PSUT2-DF(-830/-1)::GUS 與
PSUT4-DF(-843/-11)::GUS。另外，將三個啟動子接在含有 intron 之 GUS 基因 之前 (附錄六)，命名為 PSUT1-DF(-1968/-10)::Ubint::GUS、
PSUT2-DF(-830/-1)::Ubint::GUS 與 PSUT4-DF(-843/-11)::Ubint::GUS (圖二 十)，接好之質體 DNA 再以 SacI 與 SmaI 兩限制酵素作用後進行電泳分析，確 定片段無誤後定序以確定載體構築成功。
8.2. 建構 OsSUT4 基因不同長度啟動子暫時性表現載體
設 計 PSUT4 上 專 一 性 引 子 : PSUT4-DF2-SacI 、 PSUT4-DF2a-SacI 、 PSUT4-DF3-SacI、PSUT4-DF3a-SacI、PSUT4-DF4-SacI、PSUT4-DF5-SacI、
PSUT4-DF6-SacI 、 PSUT4-DF7-SacI 與 PSUT4-R4-smaI ( 表 七 ) ， 以 PSUT4-DF(-843/-11)::Ubint::GUS 質體 DNA 當作模板，進行 PCR 反應 (PCR
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條件與上述合成OsSUTs 基因啟動子之條件相同)，分別合成出 633、592、540、
473、424、318、238 及 129 bp 之 5’端 deletion 啟動子片段，合成出片段以 SacI 及SmaI 限制酵素作用後，接於含有 intron 之 GUS 基因之前 (圖二十二) 並送 定序確認無誤。
8.3. 抽取使用於基因槍射擊的質體 DNA
參考QIAGEN Plasmid Purification Handbook，抽取高純度質體 DNA 進行 基因槍暫時性表現分析。
8.4. 微攜帶子 (microcarrier) 的準備與 DNA 包覆
根據Sanford等人 (1993) 的方法，準備基因槍射擊用的微攜帶子(鎢粒子) (1) 秤取60 mg鎢粒子 (Bio-Rad, USA) 於1.5 mL的微量離心管中，加入1 mL
100% ethanol後，強力振盪10分鐘。
(2) 以桌上型微量離心機離心5秒，使鎢粒子沉澱。
(3) 移除上清液，加入1 mL無菌水清洗，強力振盪1分鐘後室溫靜置1分鐘。
(4) 再以微量離心機離心5秒，使鎢粒子沉澱。
(5) 移除上清液後重複步驟3-4二次。
(6) 加入1 mL滅過菌之50% glycerol，使最終濃度達60 mg/mL，每50 μL分裝於 1.5 mL微量離心管中，使每管微攜帶子含量為3 mg，保存於-20℃備用。
(7) 將6 μg啟動子暫時性表現質體DNA與6 μg pAHC18質體DNA (附錄三) 在 1.5 mL離心管中混合均勻。
(8) 將製備好之鎢粒子強力振盪，使鎢粒子均勻散布在溶液中。
(9) 一邊以Scientific Industries vortex-genie 2 機型之level 6強度進行振盪，一邊 緩速且依序加入步驟1混合均勻的質體DNA、50 μL 1M CaCl2及20 μL 0.1M spermidine (需新鮮配製) 後，持續振盪1分鐘。
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(10) 於室溫靜置5分鐘。
(11) 以微量離心機離心2秒使鎢粒子沉澱後，以pipetman小心移除上清液。
(12) 加入100 μL 70% ethanol後並立即以pipetman小心移除上清液。
(13) 加入140 μL 100% ethanol，以低速振盪2-3秒使鎢粒子懸浮，即製備完成。
8.5. 基因槍射擊
(1) 將巨攜帶子 (macrocarriers)、巨攜帶子支撐物 (macrocarrier holder)、破裂 圓盤 (rupture disk)、破裂圓盤保持蓋 (rupture disk retaining cap)、微攜帶子 送出組 (microcarrier launch assembly) 及停止屏 (Stoping screen) 以 70%
ethanol 滅菌後，放置無菌操作台吹乾，將 macrocarriers 裝載在 macrocarrier holder 上。
(2) 將帶有DNA的鎢粒子平均塗抹於macrocarriers/macrocarrier holder上。
(3) 打開氦氣筒氣閥，確定氦氣筒壓力保持大於粒子撞擊衝破圓盤所需壓力 200 psi左右。
(4) 打開PDS-1000/HE基因槍 (Bio-Rad, CA) 電源開關，以70% ethanol消毒基 因槍內壁。
(5) 將消毒過之rupture disk置入rupture disk retaining cap中，放置於氣體加速管 末端，以專用板手 (torque wrench)鎖緊。
(6) 將macrocarriers與stoping screen置入microcarrier launch assembly中。
(7) 將microcarrier launch assembly與目標細胞置入射擊腔適當位置，把門關上 後將射擊腔抽真空，當真空度達26-27 inch-Hg時，快速壓住Hold鈕使壓力 固定。
(8) 一直壓住Fire 鈕直到破裂圓盤破掉且壓力值達零才放開。
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8.6. 萃取水稻葉鞘蛋白質
參考 Shen (1996) 等人之方法，萃取水稻葉鞘蛋白質以及進行 GUS 及 Luciferase 活性分析
(1) 使用 KURABO SH-100 均質機及 5 mm 鋼珠，以 1,400 rpm、30 秒兩次之 條件將葉鞘撞擊成粉狀。
(2) 加入 1 mL 萃取液 (100 mM NaPO4, pH7、5 mM DTT、3 mg leupeptin、50%
(v/v) glycerol) 混合均勻。
(3) 以 4℃、13,250 x g 離心 10 分鐘。
(4) 將上清液吸到新的離心管中，分別吸取 100 μL 進行 Luciferase 及 GUS 酵 素活性測定，其他保存在-20℃中。
8.7. Luciferase 活性測定
(1) 先配製 2X Luciferase Assay Buffer (LAB) 儲存液 ( 60 mM Tris-SO4 ,
pH7.7、20 mM MgCl2、20 mM DTT、2 mM EDTA)，放置-20℃備用。
(2) 準備 1 X LAB + 0.5 mM Luciferin (100 μL/sample，每次至少配製 3 mL)，置 冰上且避光。
(3) 再配製 2 X LAB+2 mM ATP (100 μL/sample)，配製完放置冰上備用。
(4) 將 1 X LAB+0.5 mM Luciferin 注入到 Lumat LB 9507 冷光儀之 inject1 管子 中，吸取100 μL 2 X LAB+2 mM ATP 至測量玻璃試管底部，再加入 100 μL 樣品液，混合均勻後測定冷光強度。
8.8. GUS 活性測定
(1) 吸取 100 μL 萃取液到微量離心管中，加入 200 μL GUS Assay Buffer (2.5 mM 4-methylumbelliferyl β-D-glucuronide (MUG)、50 mM NaPO4 , pH7、10 mM EDTA、10 mM DTT、20 μg/mL leupeptin、20% (v/v) methanol、0.02%
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sodium azide)，混合均勻。
(2) 於 37 ℃培養 20 小時。
(3) 加入 800 μL Carbonate Stop Buffer (0.2M Na2CO3, pH11.2) 終止反應。
(4) 分別取 200 μL 標準品及樣品液至微量測試盤 (Labsystem CLINIPLATE) 小槽 (well) 中，使用 Labsystems Fluoroskan Ascent FL (Type374) 螢光測量 儀測定螢光強度 (Filter : Excitation 355 nm，Emission 460)，將機器所得數 值直接除以Luciferase 數值，得到 GUS 相對表現量。