參考Panomics操作手冊 (EMSA ”Gel Shift” Kit )，進行細胞核蛋白與PSUT4 啟動子片段的結合分析
9.1. 製備 DNA 探針
分 別 利 用 PSUT4-DF3-Biotin 、 PSUT4-DR3 與 PSUT4-DF2-Biotin 、 PSUT4-DR2 兩對引子 (表七)，以 PSUT4-DF(-843/-11)::Ubint::GUS 質體 DNA 當作模板，進行 PCR 反應合成具有 Biotin 標定的 DNA 探針，分別命名為 DF(-550/-484) (67 bp)與 DF(-643/-603) (41 bp) (圖二十四)。利用 PSUT4-DF3、
PSUT4-DR3 與 PSUT4-DF2、PSUT4-DR2 兩對引子合成沒有 Biotin 標定的 DNA 片段，分別當做DF(-550/-484)與 DF(-643/-603)的競爭者。
9.2. 利用 polyacrylamide gel 純化 DNA 探針
(1) 製 做 1.5 mm 厚 度 5% Non-denaturing polyacrylamide gel (2 mL 5X tris-borate/ethylenediamine tetra-acetic acid (TBE)、2.5 mL 40% Acryla-mide/Bis、0.625 mL 80% glycerol、0.02 mL tetramethylethylenediamine (TEMED)、14.58 mL dH2O、0.3 mL 10% ammonium persulfate)。
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(2) 待膠體凝固後，置於 0.5 X TBE Transfer Buffer 中。
(3) 將 DNA probe 加入 1/10 體積的 10X DNA loading dye，混合均勻後 loading 到well 中。
(4) 以 100 V 進行電泳 45 分鐘。
(5) 電泳完畢後將膠體移到含有 0.5 μg/ mL EtBr 之 0.5X TBE 中，於室溫下搖 晃20~30 分鐘。
(6) 在長波長 ( 312 nm) 的 UⅤ燈下對照 DNA marker，將含有 DNA 探針的膠 體切下，放置於微量離心管中。
(7) 以可拋棄的微量吸管頭搓碎微量離心管中的膠體。
(8) 加入 2X 體積的 Acrylamide Gel Elution Buffer (0.5 M ammonium acetate、10 mM magnesium acetate、1 mM EDTA，pH 8.0、0.1% SDS)混合均勻後，於 37℃震盪培養隔夜。
(9) 以 4℃、13,230 x g 離心 1 分鐘，將上清夜移到新的微量離心管中。
(10) 再加入 0.5X 體積的 Acrylamide Gel Elution Buffer 到原先的離心管中，短 暫震盪令Buffer 與膠體充分混合。
(11) 以 4℃、13,230 x g 離心 1 分鐘，將上清夜與步驟 9 的上清液收集在同一 離心管中。
(12) 將上清液通過 0.45 μm 之過濾膜，以去除殘留膠體。
(13) 收集濾液，於 4℃中加入 2X 體積的 100% ethanol 後放置冰上 30 分鐘。
(14) 以 4℃、13,230 x g 離心 10 分鐘，移除上清夜。
(15) 先以 200 μL TE buffer (pH8.0) 溶解 DNA，再加入 25 μl 3M sodium acetate (pH5.2)。
(16) 以 2X 體積 100% ethanol 再沉澱 DNA 一次。
(17) 以 70% ethanol 潤洗沉澱物，離心乾燥後以 50 μL Tris-EDTA (TE) buffer (pH8.0) 回溶 DNA。
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(18) 取 2 μL 進行定量，並將 DNA 濃度調整為 10 ng/ μL 後儲存於-20℃備用。
9.3. 葉鞘核蛋白萃取
參考Panomics操作手冊 (Nuclear Extraction Kit)，進行水稻葉鞘核蛋白萃取 (1) 將 0.5 g 葉鞘組織，以均質機打擊 6 秒 (轉速 13,000 rpm) 後放置冰上。在
冰上加入1 mL Buffer A working Reagent (0.96 mL 1X buffer A、10 μL 100 mM DTT、10 μL protease inhibitor、10 μL phosphatase inhibitor I、10 μL phosphatase inhibitor II)。
(2) 再以均質機打擊 6 秒 (轉速 13000 rpm) 後，放置冰上 15 分鐘。
(3) 以 4℃、850 x g 離心 10 分鐘，丟棄上清液。
(4) 在冰上加入 1 mL 新鮮 Buffer A working Reagent，以均質機敲打 6 秒後，放 置冰上15 分鐘。以 4℃、1,400 x g 離心 3 分鐘，移除上清液並將沉澱物放 置冰上。
(5) 加入 150 μL 的 Buffer B working Reagent (145.5 μL 1X buffer B、1.5 μL protease inhibitor、1.5 μL phosphatase inhibitor I、1.5 μL phosphatase inhibitor II)，並用最快的轉速震動 10 秒。
(6) 將離心管放置冰上 60 分鐘，每 20 分鐘溫和搖晃一次。
(7) 以 4℃、1,400 x g 離心 5 分鐘後，將上清液移到乾淨的離心管中。
(8) 取 2 μL 進行蛋白質定量，其於儲存在-80℃備用。
9.4. 形成 DNA –Transcription factor (DNA-TF)複合物
(1) 標準流程:在 0.2 mL 微量離心管中依序加入 1 μL Nuclear Extract (5~10 μg/μL)、1 μL poly d(I-C) (1 μg/μL)、2 μL 5X binding Buffer、5 μL nuc-lease-free water，混合均勻後在室溫放置 5 分鐘。加入 1 μL labeled TF probe (10 ng/μL)，混合均勻後於 15℃培養 30 分鐘。
(2) 競爭型流程:在 0.2 mL 微量離心管中依序加入 1 μL Nuclear Extract (5~10
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μg/μL)、1 μg poly d(I-C)、2 μL 5X binding Buffer、適量 nuclease-free water，
混合均勻後在室溫放置5 分鐘。分別加入 0、0.5 及 1 μL cold (unlabeled) TF probe (濃度為 10 ng/μL)，總體積為 9 μL，混合均勻後在室溫放置 5 分鐘。
加入1 μL labeled TF probe (10 ng/μL) 混合均勻，混合均勻後於 15℃培養 30 分鐘。
9.5. Non-denaturing polyacrylamide gel 電泳
(1) 準備 5% Non-denaturing polyacrylamide gel，浸於預冷過之 0.5X TBE 中。
(2) 先於 4℃中以 100 V 進行電泳 10 分鐘。
(3) 電泳完畢後以微量吸管清洗樣品槽。
(4) 將樣品與 1 μL loading dye 混合均勻後注入樣品槽中。
(5) 在 4℃中以 100 V 進行電泳，直到 dye 到達離底部 0.5 公分的距離為止。
9.6. DNA-TF 複合物轉印及 UⅤ-Crosslinking
(1) 電泳完畢後，將一張乾的 3MM 濾紙蓋在 gel 上，gel 會貼附於 3MM 濾紙 上，小心從玻璃板上移開濾紙與gel。
(2) 將 gel 浸放在 0.5X TBE 中，於室溫搖晃 15 分鐘。
(3) 準備一片與 gel 大小相同的 Neutrally Charged Nylon Membrane (0.45 μm) 及兩片3MM 濾紙分別浸泡於 0.5X TBE 中。
(4) 移開 Bio-Rad Trans-Blot SD 半乾式轉漬槽之安全蓋及不鏽鋼負極板。
(5) 依序在正極板上放置預先浸濕的濾紙、Nylon Membrane、gel 與另一張濾 紙，每放置一層時需移除所有氣泡。
(6) 蓋上負極板，放上安全蓋且連接電線於電源供應器上，以 24 V 進行轉印 30 分鐘。
(7) 轉印完畢之後，將 Nylon Membrane 放置在 3MM 濾紙上，貼近 gel 的面朝
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上，以XL-1000 UⅤ crosslinker 進行 crosslinking 3 分鐘。
9.7. Immobilization 與 Detection
(1) 將 Nylon Membrane 移到含有 15 mL 1X Blocking Buffer 的盒子中，在室溫 中搖晃15 分鐘。
(2) 從盒中取出 1 mL 1X Blocking Buffer 移到乾淨的微量離心管中，加入 15 μL Streptavidin- horseradish peroxidase (HRP) 並 vortex 10 秒鐘。
(3) 將稀釋好之 Streptavidin-HRP 加到盒子中，與原來的 Blocking Buffer 混合 均勻，在室溫下搖晃15 分鐘。
(4) 將含有 Streptavidin-HRP 之 Blocking Buffer 倒出，以 15 mL 1X Wash Buffer 在室溫下搖晃清洗Nylon Membrane 三次，每次 8 分鐘。
(5) 以 15 mL 1X Detection Buffer 置換 Wash Buffer，在室溫搖晃培養 5 分鐘。
(6) 將 Nylon Membrane 放置在兩片塑膠薄片中，將上面的塑膠片翻開，加入 0.5 mL Substrate Solution (50 μL Solution I、50 μL Solution II、400 μL So-lution Ⅲ) 到 Nylon Membrane 上，並完全覆蓋 Nylon Membrane。
(7) 輕壓塑膠片擠出過多的 Substrate Solution 後，於室溫培養 5 分鐘。
(8) 利用 X-ray film 壓片 2 小時進行影像呈現。