由分析葉鞘水稻蔗糖轉運蛋白於抽穗期間之表現中，發現 OsSUT1 與 4 在供 源型的葉鞘中會增加mRNA 之轉錄量，故藉由分析 OsSUT 基因不同長度啟動子之 活性，以篩選其他參與水稻葉鞘儲存-供源轉換之調控因子。首先，由 TNG67 水稻 釣取 OsSUT1、2、4 基因之啟動子：(一) OsSUT1 基因啟動子 (簡稱 PSUT1)，以 轉譯起始碼 (ATG) 之 A 為+1，擴增範圍為-10~-1968，總長為 1959 bp。與 Nippobare 水稻品種之序列 (Ac. No. AP008209, 比對範圍由 3,785,731 至 3,787,693) 進行比
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對，其同源性為99%。進一步以 PLACE 資料庫進行比對，分析啟動子上方與植物 荷爾蒙及醣類調控相關的cis-acting elements，發現 PSUT1 上與荷爾蒙有關之調控 序 列 有 ARR1AT 、 ABRERATCAL 、 ABRELATERD1 、 ABREZMRAB28 、 ABREATCONSENSUS 、 ACGTABREMOTIFA2OSEM 、 ASF1MOTIFCAMV 、 BRELATERD1、CATATGGMSAUR、DPBFCOREDCDC3、DRE2COREZMRAB17、
EMBP1TAEM、GAREAT、GT1CONSENSUS、LTRECOREATCOR15、MYB1AT、
MYBGAHV 、 MYB2CONSENSUSAT 、 MYCCONSENSUSAT 、 RYREPEATVFLEB4、WBOXATNPR1、WRKY71OS 等 22 種，與醣類反應相關的 有ACGTABOX、WBOXHVISO1、SREATMSD 等 3 種，而 TATCCAOSAMY 則 被認為同時參予在醣類和荷爾蒙的調控路徑 (圖十五)。 (二) OsSUT2 基因啟動子 (PSUT2)，擴增範圍為-1~-830，總長為 830 bp，與 Nippobare 水稻品種 (Ac. No.
AP008218, 比對範圍由 27,554,168 至 27,554,997) 之同源性為 100%。PSUT2 上與 荷 爾 蒙 調 控 相 關 的 cis-acting elements 有 ABRELATERD1 、 ARR1AT 、 DPBFCOREDCDC3、ERELEE4、GT1CONSENSUS、MYB1AT、MYCATFD22、
MYCCONSENSUSAT、WBOXATNPR1、WRKY71OS 等 10 種，而參與醣類調控 之序列僅有WBOXHVISO1 (圖十六)。(三) OsSUT4 基因啟動子 (PSUT4)，擴增範 圍為-11~-843，總長為 833 bp，與 Nippobare 水稻品種序列 (Ac. No. AP008208, 比 對範圍由35,566,742 至 35,567,574) 進行比對，所得同源性為 100%。PSUT4 具有 ABRERATCAL、ARR1AT、ASF1MOTIFCAMV、DPBFCOREDCDC3、GAREAT、
GT1CONSENSUS 、 LTRECOREATCOR15 、 MYBGAHV 、 MYCATFD22 、 MYCCONSENSUSAT、WBOXATNPR1、WRKY71OS 等 12 種與荷爾蒙有關之調 控序列，而在醣類相關的cis-acting element 中，有 PYRIMIDINEBOXOSRAMY1A 與WBOXHVISO1 兩種調控部位 (圖十七)。
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4.2. OsSUT1、2 及 4 基因啟動子於葉鞘中的暫時性表現分析
Scofield 等人 (2007) 曾經利用 OsSUT1 啟動子接上
β
-glucuronidase (GUS) 報 導基因 (PSUT1::GUS) 以及免疫定位法 (immunolocalization) 觀察蛋白質表現位 置，發現不論 PSUT1::GUS 活性及 OsSUT1 蛋白質均會在韌皮部組織中表現，故 先使用基因槍法，分析水稻韌皮部專一表現基因 (Thioredoxin h；TRXh) 之啟動子 (Ishiwatari et al., 2000) 與 GUS 報導基因於葉鞘中的活性 (PTRXh::GUS)，以確定 水稻葉鞘組織適合進行基因槍法暫時性表現分析。利用 PTRXh 專一性引子 (表 六)，並以 genomic-PCR 合成 TRXh 基因啟動子片段 (-1025/-16)，接在 GUS 報導基 因之前 (PTRXh::GUS)，於成株水稻葉鞘中進行暫時性表現。如圖十八 a 所示，PTRXh::GUS 之 GUS/LUC 比值比對照組高出 23 倍左右，結果證明可於水稻成株 葉鞘中進行基因槍法暫時性表現分析，即使位於葉鞘中間的韌皮部組織，亦可由 基因槍順利擊入並表現出GUS 活性。進行 OsSUT 基因啟動子分析時，需同時比較 儲存型葉鞘與供源型葉鞘的活性，為測試不同時期葉鞘本身對表現GUS 活性是否 具有差異性，將接有Ubiqutin 啟動子與 GUS 報導基因 (PUbi::GUS) 的質體同時表 現於儲存型與供源型葉鞘，並比較其活性差異，結果如圖十八 b 所示，兩種葉鞘 之GUS/LUC 活性沒有明顯差異，儲存型葉鞘之 GUS 活性為供源型葉鞘的 1.2 倍，
顯示不同時期葉鞘本身並不會造成GUS 活性表現有差異，這些測試可支持後續進 行OsSUT 基因啟動子分析。
雖然含有 intron 之質粒可能增強報導基因之表現，但亦有可能影響啟動子本 身之特性，因此將PSUT1 (-1968/-10)、2 (-830/-1) 及 4 (-843/-11) 啟動子分別接 上含有ubi-intron 之 GUS 報導基因 (PSUT::ubint::GUS) 與不含 ubi-intron 之 GUS 報 導 基 因 (PSUT::GUS)，同時進行基因槍暫時性表現並比較其結果。發現 PSUT1::GUS、PSUT2::GUS 及 PSUT4::GUS 三種啟動子所呈現的 GUS 活性均非 常低，但因表現趨勢與接有intron 的結果相似，故以含有 ubi-intron 的 GUS 報導 基因做為暫時性表現分析之載體 (data not shown)。
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欲知道 OsSUT 基因啟動子於兩時期葉鞘中的活性，是否與其 mRNA 表現趨 勢相符合，利用基因槍暫時性表現系統，分析儲存期 (抽穗當天) 與供源期 (抽 穗後 30 天) -2 葉葉鞘中，三種 PSUT 啟動子之表現活性。結果顯示在 PSUT1 (-1968/-10) 啟動子中，供源型葉鞘的 GUS 活性為儲存型葉鞘的 2.5 倍 (圖二十一 a)。而 PSUT4 (-843/-11) 亦在供源型葉鞘中表現出較高之 GUS 活性，與儲存型葉 鞘的倍數差異為3.9 倍 (圖二十一 a)。另外，PSUT2 (-830/-1) 在供源型葉鞘與儲 存型葉鞘中的表現沒有明顯差異 (圖二十一 a)。另一方面，將 PSUT1、2 及 4 啟 動子於葉鞘中的活性趨勢與其mRNA 於抽穗期間的表現量相比，顯示三者之 GUS 活性與內生OsSUT mRNA 表現量變化的趨勢均相符合 (圖二十一 b)。
4.3. OsSUT4 基因不同長度啟動子片段之暫時性表現分析
在PSUT1 (-1968/-10)、2 (-830/-1) 及 4 (-843/-11) 啟動子之暫時性表現分析 中，PSUT4 之 GUS 活性在抽穗前後呈現最大的倍數差異，欲找出影響表現差異之 調控因子，藉由PSUT4 之 5’端 deletion 啟動子片段進行葉鞘暫時性表現分析。首 先，採收儲存期葉鞘 (抽穗前 5 天) 及供源期葉鞘 (抽穗後 15 天)，分別將
PSUT4-DF (-843/-11)、PSUT4-DF(-643/-11)、PSUT4-DF(-434/-11) 及
PSUT4-DF(-248/-11) 不同長度 5’端 deletion 片段進行暫時性表現分析。如圖二十 三a 所示，結果顯示 PSUT4-DF(-843/-11) 於供源期葉鞘的 GUS/LUC 表現量為儲 存期葉鞘的3.7 倍，而 PSUT4-DF(-643/-11) 於供源期葉鞘的活性表現是儲存期葉 鞘的3.3 倍。此外，雖然 DF(-843/-11) 與 DF(-643/-11) 都在抽穗前後呈現相似倍 數之差異性表現，但長度較長的DF(-843/-11) 其 GUS 活性卻低於 DF(-643/-11)。
另外，PSUT4-DF(-434/-11) 與 PSUT4-DF(-248/-11) 在抽穗前後之表現沒有顯著差 別。故為了進一步釐清造成葉鞘兩時期差異性表現的調控區域，將
PSUT4-DF(-643/-11)、PSUT4-DF(-602/-11)、PSUT4-DF(-550/-11)、
PSUT4-DF(-483/-11)、PSUT4-DF(-434/-11) 及 PSUT4-DF(-248/-11) 等不同長度片
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段進行暫時性表現分析。結果顯示PSUT4-DF(-643/-11)、PSUT4-DF(-602/-11)與 PSUT4-DF(-550/-11)在抽穗前後均呈現差異性表現，分別有 5.7、4.1 與 4.4 的倍數 差異 (p-value 分別為 0.01113、0.00778 及 0.00798) (圖二十三 b)。而
PSUT4-DF(-483/-11)、PSUT4-DF(-434/-11)與 PSUT4-DF(-248/-11) 之表現結果相 似，在儲存型葉鞘跟供源型葉鞘的活性均沒有差別 (圖二十三 b)。綜合 PSUT4 不 同長度片段之暫時性表現結果得知，抽穗前後倍數變化最大的兩個落差在
-484~-550 與-603~-643 之間，暗示影響 OsSUT4 基因於抽穗後會大量表現的調控序 列可能位在這兩個區域中。
分析兩段序列之特殊cis-acting elements，結果如圖二十四所示，DF(-643/-603) 上有兩個僅出現在此區域之調控序列，分別為 (一) ACGTTBOX element (-640)，
為bZIP 轉錄因子之結合區；(二) INTRONLOWER element (-623)，已知是介入子與 表現子的黏合區 (3’ intron-exon splice junctions)。而 DF(-550/-484) 區域上亦有兩 個只出現於此區域的調控序列，分別為 (一) CURECORECR element (-506)，已知 其參與在銅離子反應與氧化反應中；(二) WBBOXPCWRKY1 element (-514)，為 WRKY1 轉錄因子結合區。
4.4. OsSUT4 基因之 DF(-550/-484)與 DF(-643/-603)啟動子片段進行 EMSA 分析 欲證實調控 OsSUT4 在抽穗後大量表現的 cis-acting elements 可能位在 DF(-550/-484)與 DF(-643/-603)兩個啟動子區域，利用具有 Biotin 標定之 DNA 片段 進行 EMSA 實驗 (圖二十四)，確定兩片段具有與核蛋白結合之能力。純化完之 DF(-550/-484)與 DF(-643/-603) 探針分別與儲存型葉鞘與供源型葉鞘的核蛋白進行 EMSA 反 應 ， 結 果 顯 示 DF(-550/-484) 與 儲 存 型 葉 鞘 核 蛋 白 會 形 成 2 個 DNA-Transcription factor (DNA-TF) 複合物 (S2 與 S3)，而與供源型葉鞘核蛋白只 會形成1 個 DNA-TF 複合物(S3) (圖二十五 a)，而 DF(-643/-603)與兩個時期的葉鞘 核蛋白均沒有形成DNA-TF 複合物 (圖二十五 b)，圖中 S1 可能為細胞質蛋白殘留
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所造成之背景值。
以0X、0.5X 與 1X 濃度之未標定 DF(-550/-484) 探針比例進行競爭型實驗，
結果顯示原本在抽穗前出現的2 個 DNA-TF 複合物 (S2 與 S3) 在 1X 的 DNA 濃度 競爭下會明顯減少，而抽穗後出現的1 個 DNA-TF 的複合物 (S3) 在 0.5X 的 DNA 濃度競爭下會完全消失。顯示抽穗前的2 個 DNA-TF 複合物 (S2 與 S3) 及抽穗後 的1 個 DNA-TF 複合物 (S3) 均為專一性結合 (圖二十六)。
4.5. OsSUT4 基因不同長度啟動子之穩定性表現分析
關於利用基因槍進行水稻葉片暫時性表現之研究非常少，欲進一步證實此系 統可於葉鞘中進行，我們轉殖OsSUT4 不同長度啟動子片段於水稻中，以轉殖株葉 鞘 GUS 活性來輔助基因槍暫時性表現系統之正確性。我們共進行 7 種質粒 DNA 之 水 稻 基 因 轉 殖 : pCamPSUT4-DF(-843/-11) 、 pCamPSUT4-DF(-643/-11) 、 pCamPSUT4-DF(-550/-11)、pCamPSUT4-DF(-434/-11)、pCamPSUT4-DF(-328/-11)、
pCamPSUT4-DF(-248/-11)及 pCamPSUT4-DF(-139/-11)，其感染癒合組織數目分別 為145、123、71、81、96、60 與 92 顆，經過 50 mg/L 之 hygromycin 篩選後，獲 得健康幼苗與白化苗，健康苗以 genomic-PCR 確定為轉殖株後，計算其轉殖效率 介於3.1~14.8% (表八)。
轉殖株再利用GUS 染色分析法觀察 PSUT4 不同長度啟動子於轉殖水稻中的 組織專一性，總共分析了 pCamPSUT4-DF(-843/-11)、pCamPSUT4-DF(-643/-11)與 pCamPSUT4-DF(-434/-11)三種長度啟動子，每個長度啟動子分析兩個獨立轉殖系 (independent lines)，如圖二十八所示，pCamPSUT4-DF(-843/-11)的 GUS 活性不論 在營養器官(葉片與葉鞘)或生殖器官(包含花、小穗軸) 的表現都非常弱，僅有在開 花後的雄蕊上偵測到微弱的GUS 活性 (圖二十八 p)。而 pCamPSUT4-DF(-643/-11) 與 pCamPSUT4-DF(-434/-11)兩種長度的啟動子片段在葉片、葉鞘與穗上均可以偵 測到GUS 活性，故 pCamPSUT4-DF(-434/-11)的啟動子長度並不影響其 GUS 組織
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表現 (圖二十八)。另外，觀察 PSUT4-DF(-434/-11)-49 轉殖系花器的染色結果時，
發現孕穗期的花葯上並沒有GUS 活性，而在開花後的花葯卻可以表現很強的 GUS 活性，推測PSUT4 在花葯的表現具有生長發育上的調控 (圖二十九 b、c)。進一步 觀察已抽出葉鞘但尚未開花的穎花，發現雌蕊會較花葯早出現GUS 反應 (圖二十 九e)，而漸漸花葯中的花粉出現 GUS 活性，花葯壁亦呈現微弱 GUS 表現 (圖二十 九f、g)。而正開完花的花葯壁則呈現很強的 GUS 活性，此時期內的花粉粒幾乎均 已釋出 (圖二十九 h、i)。
在T0 轉殖水稻中，以開花較早的主稈之-2 葉葉鞘當做供源型葉鞘材料，而 開花較晚的分蘗-2 葉葉鞘當做儲存型葉鞘材料，分別收集後進行 GUS 酵素活性分 析。總共分析了4 株 pCamPSUT4-DF(-843/-11) 獨立轉殖系、4 株
pCamPSUT4-DF(-643/-11) 獨立轉殖系與 8 株 pCamPSUT4-DF(-434/-11) 獨立轉殖 系，結果如圖三十所示，發現pCamPSUT4-DF(-843/-11)與 pCamPSUT4-DF(-643/-11) 兩種長度啟動子之轉殖株，其於供源型葉鞘中的平均活性高於儲存型的葉鞘，各 取三個獨立轉殖系將供源型葉鞘中的活性與儲存型葉鞘的活性相比，
pCamPSUT4-DF(-843/-11)為 4 倍，而 pCamPSUT4-DF(-643/-11)的倍數為 2.4 倍。
在pCamPSUT4-DF(-434/-11)轉殖株的活性分析上，大多數植株在兩個時期的葉鞘 沒有明顯差異 (圖三十)，三個獨立轉殖系的平均值為 1.1 倍。另外還發現，長度最 長的pCamPSUT4-DF(-843/-11)片段所表現的 GUS 活性雖然在抽穗前後有差異性表 現，但是相較於其他長度啟動子，其表現強度最低 (圖三十)。
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討 論
1. 水稻 TNG67 之-2 葉葉鞘為抽穗期間主要澱粉儲存組織
水稻上位葉葉鞘之暫時性儲存能力及供源強度是決定高產的重要因子之一 (Cock and Yoshida, 1972; Samonte et al., 2001)，在此論文中，我們觀察到 TNG67 水 稻之-1、-2 及-3 葉葉鞘均會於抽穗前累積澱粉，且於抽穗後開始降解，而-2 葉葉 鞘儲存-供源轉變的現像比其他上位葉葉鞘更為明顯 (圖二 a)，這個結果與 Hirose 等人 (1999) 於 Nipponbare 水稻品種中觀察到的情形相符合。另一方面，於採收材 料期間，劍葉葉鞘仍然還在生長，亦無儲存-供源轉變之情形發生，這些結果顯示 TNG67 水稻-2 葉葉鞘為抽穗前之主要澱粉暫存組織。另外，我們還測量抽穗前 20 天至抽穗後 20 天所有上位葉葉鞘及葉身長度之變化，發現-2 葉葉鞘於抽穗前 20 天已完全成熟，葉身與葉鞘幾乎已不再延長，顯示成熟之-2 葉葉鞘是當作一個儲
水稻上位葉葉鞘之暫時性儲存能力及供源強度是決定高產的重要因子之一 (Cock and Yoshida, 1972; Samonte et al., 2001)，在此論文中，我們觀察到 TNG67 水 稻之-1、-2 及-3 葉葉鞘均會於抽穗前累積澱粉，且於抽穗後開始降解，而-2 葉葉 鞘儲存-供源轉變的現像比其他上位葉葉鞘更為明顯 (圖二 a)，這個結果與 Hirose 等人 (1999) 於 Nipponbare 水稻品種中觀察到的情形相符合。另一方面，於採收材 料期間，劍葉葉鞘仍然還在生長，亦無儲存-供源轉變之情形發生，這些結果顯示 TNG67 水稻-2 葉葉鞘為抽穗前之主要澱粉暫存組織。另外，我們還測量抽穗前 20 天至抽穗後 20 天所有上位葉葉鞘及葉身長度之變化，發現-2 葉葉鞘於抽穗前 20 天已完全成熟，葉身與葉鞘幾乎已不再延長，顯示成熟之-2 葉葉鞘是當作一個儲