關於荷爾蒙是否調控蔗糖轉運蛋白表現的研究非常少，目前已知在馬鈴薯 中，GA3與ethephon會促進StSUT4的表現 (Chincinskaet al., 2008)，而StSUT1會受到 auxin (2,4-D)與cytokinin誘導而提高表現量 (Harms et al., 1994)。而水稻及阿拉伯芥 中荷爾蒙對蔗糖轉運蛋白的影響及調控機制仍然未知，在本篇論文中，我們探討 ABA 植 物 荷 爾 蒙 對 水 稻 葉 鞘 中 轉 運 蛋 白 的 影 響 ， 結 果 顯 示ABA的處理會使 OsSUT1、2及4的基因表現量都上升 (圖十三)。偵測葉鞘中ABA在抽穗期間的含量 變化，發現在抽穗後11天會有明顯的提升 (圖十四)，而OsSUT4的基因表現量也在 抽穗後7~14天有顯著上升 (圖七)。雖然ABA在葉鞘中並非關鍵調控儲存-供源轉換 的樞紐，但是其在抽穗後澱粉降解以及蔗糖轉運蛋白的調控上卻可能扮演著促進 的角色。
許多研究指出醣類濃度會影響蔗糖轉運蛋白之表現，Weber 等人 (1997)最早 研究蠶豆VfSUT1 mRNA 在不同蔗糖濃度下的表現，發現高濃度蔗糖與葡萄糖 (150 mM) 均會抑制子葉中 VfSUT1 的表現量。Chiou 及 Bush (1998) 利用切離葉片之葉 柄吸收不同濃度蔗糖溶液，證實BvSUT mRNA 表現及其酵素活性隨著濃度提升而 下降。但是在玉米、水稻及阿拉伯芥蔗糖轉運蛋白的研究卻有不一樣的發現: 阿拉 伯芥AtSUC1 會受到蔗糖誘導而提高表現量 (Sivitz et al., 2008)，而 14 天大之玉米
66
切離葉處理50 mM 的蔗糖溶液時，亦會促進 ZmSUT1 mRNA 的表現。水稻分離胚 培養在含有100 mM 蔗糖及葡萄糖的培養基時，胚中 OsSUT1 的表現量會升高，且 會隨著培養時間越長而表現量越高 (Matsukura et al., 2000)。柑橘中蔗糖轉運蛋白 CitSUT1 與 CitSUT2 不但表現部位不同，其對醣類的反應也不一致，CitSUT1 主要 表現在供源組織及醣類輸出的器官，並且會受到外加蔗糖、葡萄糖與甘露糖的抑 制，而 CitSUT2 主要表現在儲藏組織等需要醣類輸入的器官，而不受上述醣類的 施加而有所影響 (Yao et al., 2003)。這些前人研究暗示，蔗糖轉運蛋白的調控似乎 並非單子葉與雙子葉的差別，不同isoform 之調控特性亦可能具備組織專一性。由 我們的研究中發現，抽穗後的葉鞘其蔗糖與葡萄糖含量都會上升 (圖三)，而蔗糖 含量變化與OsSUT1 基因表現變化趨勢完全相同，都於抽穗後 6-7 天達到最高峰，
接著下降，暗示葉鞘中蔗糖可能為誘發OsSUT1 基因在抽穗後表現量上升的調控因 子。葡萄糖含量變化趨勢則與OsSUT4 基因表現相似，於抽穗後緩慢上升，推測葡 萄糖濃度影響OsSUT4 於葉鞘中的表現。OsSUT1 基因啟動子上具有 4 種與醣類反 應 相 關 之 調 控 區 域 ( ACGTBOX 、 SREATMSD 、 TATCCAOSAMY 與 WBOXHVISO1) ， 而 OsSUT4 基 因 啟 動 子 上 有 兩 種 (WBOXHVISO1 與 PYRIMIDINEBOXSRAMY1A)。利用水稻分離胚探討醣類對 OsSUT1 與 OsSUT4 基因表現的調控機制，發現短時間處理下 (24 小時)，葡萄糖會促進 OsSUT4 之表 現 (陳, 2007)，而 OsSUT1 對葡萄糖的處理於短時間及長時間上呈現不同反應，短 時間處理葡萄糖抑制OsSUT1 表現，卻於長時間 (120 小時) 處理時促進其表現。
葉鞘與胚為兩種結構功能相異之組織，葉鞘中蔗糖轉運蛋白是否與胚中之調控方 式相同，必須依賴更進一步的實驗佐證，但於初步試驗可以瞭解抽穗後葉鞘蔗糖 與葡萄糖濃度提升，伴隨OsSUT1 與 OsSUT4 基因表現量上升，推測醣類參與在供 源型葉鞘中蔗糖轉運蛋白之表現。
67
6. 調控葉鞘中 OsSUT4 在抽穗後大量表現之啟動子區域
本論文先前之研究顯示 OsSUT1 及 OsSUT4 在水稻上位葉葉鞘之表現會在抽 穗之後明顯增強，推測此二OsSUT 為主要負責蔗糖進行 phloem loading，以促進蔗 糖由葉鞘轉運至榖粒之主要蔗糖轉運蛋白 (Chen and Wang, 2008)。進而，我們藉 由分析水稻OsSUT 基因於生殖生長期在葉鞘中表現之分子調控，探討水稻葉鞘將 蔗糖轉運至充實中之穀粒的調控機制。首先，擴增TNG67 水稻 OsSUT1
、
2、
4 基 因的啟動子區域 (圖十五~十七)，並構築暫時性表現載體。分析報導基因在抽穗前 後的差異表現，並比對三個蔗糖轉運蛋白mRNA 層次上的表現 (圖二十一)，發現 OsSUT1 與 4 不論是 RNA 表現或啟動子活性都呈現抽穗後高於抽穗前的趨勢，而 OsSUT2 則在抽穗前後均沒有明顯差異。進一步利用暫時性表現系統分析 OsSUT4 不同長度啟動子之活性，結果顯示啟動子由-643 縮短到-603 及-550 縮短到-484 時，其在供源型葉鞘增強表現之情形便消失 (圖二十三 b)。以 electrophoresis mobility shift assay (EMSA)技術證實 DF(-550/-484)片段分別與抽穗前與抽穗後葉鞘核蛋白 均可結合，並於抽穗前後有差異性 (圖二十五)一般來說，於 EMSA 膠體中造成移 動能力 (mobility) 降低的因子有(1)蛋白質與核酸的大小; (2) 結核蛋白的個數; (3) 蛋白質的帶電性; (4) 核酸構型的改變等四種 (Fried, 1989)。使用粗萃取之細胞核 蛋白進行EMSA 實驗時，於鑑定結果上較純化蛋白複雜，探討我們實驗結果的可 能解釋有三種 : (1) 抽穗前有兩種 TF 競爭同一個結合區，抽穗後只有其中一種 TF；(2) 抽穗前有兩種調控蛋白，一個具有與 DNA 序列結合之能力，另一個具有 與蛋白質結合之特性，抽穗後只剩下可與DNA 結合之調控蛋白；(3) 抽穗前有兩 種 TF，分別結合於不同調控區域，供源型葉鞘則只剩下其中一種 TF。未來藉由 Yeast One-hybrid 技術可以找出第一與第三種假設下之關鍵調控蛋白，而第二種假 設之重要調控蛋白則需要搭配 DNA affinity column、2D EMSA 或是 mass spec-trometry 等方法 (Woo et al., 2002; Stead et al., 2006)，來幫助鑑定結合蛋白之個數與 種類。
68
我們於67 bp之DF(-550/-484)上比對到9個已知的cis-acting elements (圖二十四) (表九)，而其中WBBOXPCWRKY1、WBOXATNPR1與CURECORECR等三種僅存 在於OsSUT4啟動子-484上游處。於前人研究中，WBBOXPCWRKY1 (TTTGACY) 及WBOXATNPR1 (TTGAC) 屬於與病原反應相關之調控區域 (Eulgem et al., 1999)，分別被發現在荷蘭芹Pathogenesis-Related Class 10 (PR10)、WRKY1與阿拉 伯芥之NPR1基因啟動子上，而相對之trans-acting elements於前者為一促進子，於 後 者 則 為 一 抑 制 子 。 相 同 位 置 (-512/-509) 之 W box (TGAC) 也 被 認 為 是 WBOXHVISO1、WBOXNTERF3與WRKY71OS等調控區，WBOXHVISO1為大麥 SUSIBA1與SUSIBA2轉錄因子的DNA結合序列，與醣類調控有關 (Sun et al., 2003);
WBOXNTERF3位於菸草抑制型轉錄因子ERF3啟動子中，參與此基因受傷誘導之 調控路徑 (Nishiuchi et al., 2004) ;而WRKY71OS於先前提過，位在α-amylase基因啟 動子上，於糊粉層細胞中扮演溝通GA及ABA訊息傳導之角色(Zhang et al., 2004;
Xie et al., 2005)。這些相對應之轉錄調控因子，於先前研究敘述均具不同調控特性 與生理功能，而在葉鞘中是否也具有同樣表現特性，還需要更多實驗來佐證。
WRKY是一非常龐大之轉錄因子基因家族，在水稻基因組中預測之WRKY基因已有 一百多個，多數基因其功能都尚未清楚，不排除有未知WRKY基因於水稻葉鞘儲存 -供源轉換時扮演調控之角色。CURECORECR調控區位於綠藻cytochrome c6 (Cyc6) 及 coprogen oxidase (Cpx1)基因啟動子上，與缺氧反應及銅離子感應有關 (Lu and Stemler, 2002)，而在葉鞘中的功能仍須實驗證明。Schneidereit等人 (2008)曾於阿 拉 伯 芥 轉 殖 株 中 分 析AtSUC 基 因 不 同 長 度 啟 動 子 活 性 ， 推 測 需 要 同 時 具 有 AAT(A/T)ATT (HD-Zip轉錄因子結合區) 與CTTT (DOF轉錄因子結合區) 兩種 cis-acting element，才能調控AtSUC基因於供源型葉片大量表現。而在PSUT4中，
並未發現任何HD-Zip轉錄因子結合區，暗示影響OsSUT4基因於供源型葉鞘大量表 現的調控機制與AtSUC基因並不相同。另外，PSUT4之DF(-550/-484)區域中，與W box (-512/-509) 重疊一個反向的DOF轉錄因子結合區 (CTTT；-515/-512)，由前人
69
研究知道反向的cis-acting element也可能具有功能 (Schneidereit et al., 2008)，重疊 的調控位置是否因此造成兩種轉錄因子共同競爭，仍須要更多實驗來證明。
7. 葉鞘組織暫時性表現系統之建立
為了檢測葉鞘基因槍暫時性表現系統之效率，我們分析水稻韌皮部專一表現 基因 (TRXh) 之啟動子於成株水稻中的暫時性表現，結果顯示可於葉鞘組織中偵 測 到 明 顯 的GUS 活 性 ( 圖 十 八 a) 。 另 外 ， 由 pCamPSUT4-DF (-843/-11) 、 pCamPSUT4-DF(-643/-11)與pCamPSUT4-DF(-434/-11)三種長度啟動子片段之轉殖 株活性分析，分別得到供源型葉鞘與儲存型葉鞘的活性比值為4、2.4與1.1倍 (圖三 十)，而由基因槍進行暫時性表現所得之比值為3.7、3.3與1.4倍 (圖二十三a)，兩種 實驗方法之結果同時顯示，PSUT4-DF(-434/-11) 啟動子長度即失去於供源型葉鞘 大量表現之活性，進一步證實葉鞘基因槍暫時性表現系統的正確性。
8. 結語與未來展望
本論文為瞭解水稻葉鞘於抽穗期間儲存–供源轉換的分子調控機制，首先篩 選出參與水稻葉鞘儲存-供源轉換之標識基因，包含醣類代謝相關基因 (AGP-L2、
GBSSII、SSSI、SBEI、SBEIII、SBEIV、sucrose synthase與 β-amylase)、蔗糖轉運蛋 白 (OsSUT1與OsSUT4) 及分子轉運蛋白 (putative sorbitol transporter、ammonium transporter與phosphate transporter) 等基因。藉由分析澱粉合成相關基因啟動子序 列及荷爾蒙實驗，得知ABA雖然並非是誘導葉鞘儲存-供源轉變之主因，但其可能 於供源型葉鞘中促進澱粉分解及蔗糖轉運蛋白基因表現。我們也發現葡萄糖與蔗 糖含量於抽穗後上升的趨勢與蔗糖轉運蛋白表現量相似，暗示其極可能影響蔗糖 轉運蛋白在葉鞘中的表現，而醣類分子與ABA之間是否對蔗糖轉運蛋白有共同協 調的關係存在，未來可以利用荷爾蒙抑制劑的處理來佐證。利用啟動子分析來了 解水稻蔗糖轉運蛋白於供源型葉鞘中表現的分子調控機制，得到一段67 bp之啟動
70
子序列，其可能包含調控蔗糖轉運蛋白於抽穗後大量表現的調控區域。未來，尋 找這段啟動子片段上之結合轉錄因子以及證實該轉錄因子之調控特性將是首要工 作，預期能藉此更了解水稻葉鞘儲存-供源轉換之分子調控機制，在未來，可以應 用於增強水稻葉鞘於抽穗前儲存醣類之能力或抽穗之後之供源強度，以提高水稻 產量及降低環境逆境對水稻減產之衝擊。
71
參考資料
陳佳宜 (2007) 水稻種子發芽時期胚中蔗糖轉運蛋白基因之表現調控機制。國立臺灣大學生物資源 暨農學院農藝系碩士論文。
Abe H, Yamaguchi-Shinozaki K, Urao T, Iwasaki T, Hosokawa D, Shinozaki K (1997) Role of ara-bidopsis MYC and MYB homologs in drought- and abscisic acid-regulated gene expression. Plant Cell 9:1859–1868
Abe H, Urao T, Ito T, Seki M, Shinozaki K, Yamaguchi–Shinozaki K (2003) Arabidopsis AtMYC2 (bHLH) and AtMYB2 (MYB) function as transcriptional activators in abscisic acid signaling. Plant Cell 15: 63–78
Akihiro T, Mizuno K, Fujimura T (2005) Gene expression of ADP–glucose pyrophosphorylase and starch contents in rice cultured cells are cooperatively regulated by sucrose and ABA. Plant Cell Phy-siol 46: 937–946
Aloni B, Daie J, Wyse RE (1986) Enhancement of ['^C]sucrose export from source leaves of Vicia faba by gibherelhc acid. Plant Physiol 82: 962-966
Aoki N, Hirose T, Scofield GN, Whitfeld PR, Furbank RT (2003) The sucrose transporter gene family in rice. Plant Cell Physiol 44: 223–232
Baba I, Kittaka A (1953) On the accumulation of starch grains at the shoot base of the rice plant. Proc
Baba I, Kittaka A (1953) On the accumulation of starch grains at the shoot base of the rice plant. Proc