由葉鞘中澱粉合成相關基因於抽穗期間之表現變化分析結果得知，有六個基 因 (AGP-L2、GBSSII、SSSI、SBEI、SBEIII 及 SBEIV) 與葉鞘澱粉含量變化相關性 相當高，推測其為主要影響抽穗前澱粉大量累積之主要基因，欲找尋水稻葉鞘由 儲存組織轉變成供源組織時期，調控此六個澱粉合成基因表現之上游因子，由 NCBI 網站搜尋 Nipponbare 水稻品種基因組 DNA，擷取六個關鍵基因轉譯起始碼 (ATG) 上游 1.5-kb 序列 (5＇-flanking sequence)。利用 Plant Cis-Acting Regulatory DNA Elements (PLACE) 網站搜尋位於這些基因上游序列之 cis-acting elements，經 過比對發現有五個與荷爾蒙訊息傳導相關之調控序列位在所有基因之上游序列 中，如表五所示，這些調控序列分別為 : (一) ARR1AT element，其與細胞分裂素 (cytokinin) 的反應有關 (Ross et al., 2004) ; (二) DOFCOREZM element，為 DOF 轉 錄因子之結合區，目前已知水稻之 DOF3 會與 GAMYB 轉錄因子鍵結，幫助 GAMYB 與 GARE element 之結合，促進 GA-response 的下游基因表現 (Washio, 2003) ; (三) MYBCORE element，是與 GA 及 ABA 反應有關的調控區域 (Abe et al., 1997; Washio, 2003)；(四) MYCCONSENSUSAT element，已知其參與在 ABA 的訊 息調控路徑上 (Abe et al., 2003)；(五) WRKY71OS element，為 WRKY71 轉錄因子 之結合區，被認為是參與在ABA/GA 之訊息反應中 (Zhang et al., 2004; Xie et al., 2005)。另外，還發現有三個與光訊息傳導相關的 cis-acting elements，也同樣位於 六個澱粉合成基因上游序列中 (表五)：(一) GT1CONSENSUS element，被發現位 在許多與光反應有關之基因啟動子區域 (Villain et al., 1996)；(二) INRNTPSADB element，為一些光反應基因啟動所需之調控區，在功能上可以取代 TATA box (Nakamura et al., 2002)；(三) GATABOX element，目前已知與光調控有關 (Lam and Chua, 1989)。
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3.2. 荷爾蒙相關轉錄因子-OsDOF3 與 OsWRKY71 在葉鞘中於抽穗期間之表現分析 由比對 AGP-L2、GBSSII、SSSI、SBEI、SBEIII 及 SBEIV 六個澱粉合成基因 上游序列結果得知，他們共同具有五個與荷爾蒙反應相關之 cis-acting elements，
搜尋 database 上水稻中已知的結合 trans-acting elements，得到兩個轉錄因子 (OsDOF3 與 OsWRKY71)，為探討這兩個轉錄因子是否可能參與在葉鞘儲存-供源 轉換的調控過程中，收集抽穗前14 天與抽穗後 0、14 天之水稻-2 葉葉鞘，設計專 一性引子 (表一) 並以 real-time RT-PCR 技術分析其基因表現變化。如圖十結果所 示，OsDOF3 於儲存期葉鞘中的基因表現高於供源期葉鞘中的表現，抽穗前 14 天 的表現量為抽穗後14 天的 2.4 倍。而 OsWRKY71 之 mRNA 含量則是在抽穗之後增 多，抽穗後14 天之表現量為抽穗前的 3.4 倍 (圖十)。兩個轉錄因子在抽穗期前後 均表現出明顯的差異性，推測其可能亦參與葉鞘儲存-供源轉變之調控途徑中。
3.3. 植物荷爾蒙對切離葉鞘中澱粉含量的影響
為了瞭解植物荷爾蒙是否為調控水稻葉鞘中澱粉含量變化的因子，將抽穗前及 抽穗後 7-10 天之-2 葉葉片由水稻植株上切離下來，分別浸泡在含有 100 μM 之 GA、ABA 及 BAP 水溶液中，經過 24 小時處理後，觀察葉鞘的生長狀況並測定其 中澱粉含量。測量儲存期對照組 (僅處理水) 葉身與葉鞘的生長情形，發現這個時 期-2 葉葉鞘和葉身還會有延長的趨勢，其中葉身伸長 0.2~0.25 公分，而葉鞘大約 只伸長0.05 公分。另外，在 GA 的處理中，葉鞘和葉身都比對照組明顯有更加伸 長的趨勢，葉身大約伸長0.4~0.45 公分，而葉鞘則伸長 0.1~0.2 公分，此結果證實 GA 處理為有效處理 (圖十一 a)。而儲存期葉鞘在 ABA 的處理中完全停止生長，
且葉身的生長也比對照組慢，僅生長0.05~0.1 公分 (圖十一 a)，進一步使用 real-time RT-PCR 分析 OsRab16A (ABA 誘導表現基因) 基因於 ABA 處理葉鞘中的表現，發 現其表現量大約為對照組葉鞘的60 倍 (data not shown)，證實 ABA 於葉鞘中亦為 有效處理。而BAP 則對儲存期葉鞘與葉身之生長沒有影響 (圖十一 a)。另外，抽
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穗後7-10 天的葉鞘在三種荷爾蒙處理中均不再延長，表示此時的-2 葉葉片已經完 全停止生長 (data not shown)。
儲存期葉鞘在GA 及 ABA 的處理下都會使澱粉含量下降，分別為對照組的 0.64 與0.65 倍，而 BAP 對儲存期葉鞘中的澱粉含量成現正調控，並與對照組相比為對 照組的1.25 倍 (圖十一 b)。供源型葉鞘處理三種荷爾蒙的結果和儲存型葉鞘相似，
ABA 使葉鞘澱粉減少為對照組的 0.29 倍，而 BAP 使葉鞘中的澱粉含量比對照組 高出2 倍，另一方面，GA 會輕微提升供源型葉鞘澱粉含量 (圖十一 c)。綜合結果 來看，ABA 會降低水稻葉鞘中暫存性澱粉之含量，BAP 則會使其含量輕微增高，
而GA 對葉鞘澱粉含量影響並不穩定。
3.4. 植物荷爾蒙 ABA 對切離葉鞘中澱粉代謝相關酵素活性及 OsSUTs 基因表現的 影響
由切離葉鞘處理荷爾蒙之試驗，得知ABA 會降低葉鞘中澱粉含量變化，欲進 一步證實ABA 是否藉由調控澱粉代謝相關酵素之活性，進而影響葉鞘澱粉含量，
收取抽穗前7-10 天水稻-2 葉切離葉鞘，處理 100 μM ABA 24 小時，而後測定澱粉 合成相關酵素 (AGPase、GBSS、SSS 及 SBE) 與澱粉分解酵素 (α-amylase 及 β-amylase) 之活性。如圖十二所示，結果顯示 ABA 不會顯著影響 SBE 及 SSS 之 酵素活性 (圖十二 b、d)，而會使 AGPase 與 GBSS 的酵素活性降低，其 p-value 分 別為0.0176 與 0.0007。在澱粉分解相關酵素的影響上，發現 ABA 會促進 α-amylase 及β-amylase 酵素活性高達兩倍以上 (p-value 分別為 0.0007 與 0.0131)，綜合結果 來看，ABA 會抑制 AGPase 及 GBSS 的酵素活性 (圖十二 a、c )，而大量提升 α-amylase 與 β-amylase 的酵素活性 (圖十二 e、f)。
除了前述澱粉合成與澱粉分解相關酵素會受到ABA 顯著影響，我們也觀察水 稻蔗糖轉運蛋白在 ABA 處理中的基因表現變化。收取抽穗前 7-10 天經 100 μM ABA 處理 24 小時之水稻-2 葉葉鞘，以 OsSUTs 基因專一性引子 (表一) 進行
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real-time RT-PCR，分析 OsSUT1、2、3、4 及 5 基因表現變化。結果如圖十三所示，
除了OsSUT3 及 5 因表現量太低而偵測不到之外，OsSUT1、2 及 4 均受 ABA 正向 調控 (其 p-value 分別為 0.0256、0.0010 與 0.0025)，於 ABA 處理下，分別使 OsSUT1、
2 及 4 之基因表現量提升為對照組的 2.4、2.2 與 2.1 倍。
3.5. 抽穗期間水稻葉鞘中內生 ABA 含量與澱粉分解酵素活性變化
欲了解 ABA 是否在葉鞘中參與澱粉代謝之調控，或扮演著調控儲存-供源轉 換的角色，我們採收抽穗前3 天到抽穗後 25 天成株水稻-2 葉葉鞘，每 7 天為一個 間隔，偵測葉鞘內澱粉含量、內生ABA 含量變化及澱粉分解相關酵素之活性變化，
並分析其彼此間的相關性。由實驗結果得知，澱粉累積量最高峰在抽穗前 3 天，
抽穗後澱粉快速降解 (圖十四 a)，而 ABA 含量從抽穗前 3 天至抽穗後 11 天的變 化不大，於抽穗後 11 天開始上升，到了抽穗後 18 天出現最大量，之後又繼續下 降 (圖十四 b)。另外，在採收的時期中，葉鞘中α-amylase 的活性僅於抽穗後 11 天些微上升，於其他時間點並無明顯變化 (圖十四 c)。相較於α-amylase 活性的改 變，β-amylase 之活性變化較為顯著，其於抽穗前 3 天即開始上升，從抽穗後 4 天 到25 天都維持在高活性的區域 (圖十四 d)。
4. 探討水稻葉鞘於儲存-供源轉換時，調控 OsSUT 基因表現之訊息因子