水稻葉鞘儲存-供源轉變之標識基因

Watanabe 等人 (1997) 研究水稻葉鞘於抽穗期間澱粉代謝相關酵素的活性變 化，結果顯示 SBE、GBSS 與 SSS 均為葉鞘中調控澱粉合成的主要酵素，尤其以 SBE 活性變化與澱粉含量變化之相關性最高 (Watanabe et al., 1997)。為了進一步探 討水稻葉鞘由儲存組織轉變成供源組織之分子調控機制，此論文中顯示 3 個 SBE 之isogenes (SBEI、III 及 IV) 均與澱粉含量變化呈現高度正相關，另外，AGP-L2、

GBSSII 與 SSSI 之表現，也與抽穗期間的澱粉量成正相關 (表二)，推測這些基因為 影響抽穗前葉鞘澱粉大量累積之主要基因。

另一方面，這些與澱粉代謝相關基因可依其在抽穗期間的變化趨勢分成三群:

第一群基因於抽穗前 20 天即達到最高表現量；第二群基因有於抽穗前 20 天僅具 中度表現量，之後開始上升，直到抽穗前10 天達到高峰；第三群基因在抽穗前 20 天至10 天都呈現低表現，但於抽穗當日會大量表現 (圖五)。不僅是葉鞘，在充實 階段之水稻穀粒，澱粉合成相關基因也具有分群表現的關係存在 (Ohdan et al., 2005; Dian, 2005)，暗示這群基因可能由不同的因子在調控，造成於時間分佈上呈 現先後表現的順序。

在本篇論文中，我們也利用 microarray 技術去探討葉鞘中整個水稻 genome 在 抽穗期間之表現，期望能對於葉鞘儲存-供源轉換之生理意義及分子調控機制更為 明瞭。結果顯示，有許多基因於儲存期葉鞘與供源其葉鞘中呈現不同表現 (圖八、

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表四)，其中包含了醣類代謝 (carbohydrate metabolism)、分子運輸 (molecule transport)、訊息傳導/轉錄調控 (signal transduction/transcriptional regulation)、荷爾 蒙合成 (hormone biosynthesis) 與生長發育調控 (developmental regulation) 等相關 基因。在醣類代謝相關基因中，sucrose synthase 和澱粉含量的變化呈現正相關 (圖 九a)，根據最近的研究，sucrose synthase 可以控制 ADP-glucose 及暫存性澱粉在葉 片中的累積量，若在一轉殖植物中大量表現 sucrose synthase (SUS)基因，葉片中 ADP-glucose 及暫存性澱粉之含量都會被大量提升 (Muñoz et al., 2005)，暗示 SUS 基因於儲存階段的葉鞘中表現量若被提高，可能同時促進了澱粉的合成。SUS 酵 素分解蔗糖後所形成的UDP-glucose，可再經由 UDPG pyrophosphorlase 及 ADPG pyrophosphorlase 作用生成 ADP-glucose (Denyer et al., 1996)，或是直接利用 ADP 為反應基質合成ADP-glucose (Baroja-Fernandez et al., 2003)，而 Wang 等人 (1999) 利用免疫組織化學法 (immunohistochemical) 分析水稻三個 SUS 基因之表現位 置，發現Microarray 偵測到的 SUS2 會表現在葉部韌皮部與葉肉細胞中，暗示其功 能可能為催化蔗糖以提供水稻葉鞘澱粉合成的前驅物，或是提供伴細胞進行呼吸 作用、蔗糖卸載時所需之能量 (Hanggi and Fleming, 2001)。

另一個與醣類代謝相關的基因 - β-D-glucan exohydrolase 之 mRNA 在抽穗前含 量遠高於抽穗後(圖九 a)，這個酵素已知參與在種子發芽階段、鞘葉延長及果實成 熟時植物細胞壁的鬆弛與降解之過程 (Varghese et al., 1999; Lazan et al., 2004)，而 其在葉鞘中的生理意義及功能仍需要被研究與探討。

β-amylase 則是在抽穗後澱粉快速降解時具有高度表現，推測其極有可能扮演 著水稻在抽穗之後，水解葉鞘澱粉之主要角色 (圖六 d)。另外，Perez (1971) 與 Ishimaru 等人 (2004) 發現莖稈和葉鞘中的 α-amylase 酵素活性在抽穗期間會增 加，然而，前人研究指出α-amylase3D 基因在葉鞘抽穗後並沒有明顯提高其表現量 (Takahashi et al., 2005)，故我們偵測了葉鞘中 α-amylase 1A

、

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於抽穗後有提高表現 (圖六 a-c)。一般來說，發芽中的水稻種子富含 α-amylase，

且主要負責分解種子胚乳內儲藏的澱粉，而在阿拉伯芥的葉片，澱粉粒主要由 β-amylase 水解成 maltose，並且是葉綠體中澱粉降解之主要途徑 (Smith et al., 2005)，暗示不同組織間澱粉水解機制可能不盡相同。

除了澱粉降解，醣類裝載 (loading) 至韌皮部並轉運到其他儲藏組織是供源組 織的另一個重要特性，阿拉伯芥的蔗糖轉運蛋白- AtSUC2 就被認為是葉片由儲存 組織轉變成供源組織之主要標識基因 (Wright et al., 2003)。而於水稻葉鞘儲存-供 源轉換時期，OsSUT1 之 mRNA 含量會隨著抽穗而增高 (Hirose et al., 1999, 圖七 a)，除了 OsSUT1 之外，我們也探討了水稻另外 4 個 SUT 基因於抽穗期間的表現，

結果顯示OsSUT4 基因也呈現在抽穗之後會提高表現量的趨勢 (圖七 c)，推測這兩 個水稻蔗糖轉運蛋白可能在葉鞘中扮演著將蔗糖裝載到韌皮部中之重要角色，而 OsSUT1 已經被證實於葉片中具有裝載蔗糖之功能 (Ishimaru et al., 2001; Scofield et al., 2002)。

除了OsSUT 基因外，由 microarray 與 real-time RT-PCR 分析也發現一個 putative sorbitol transporter 於抽穗前後具有差異性表現 (圖九 b)，在一些水果中，sorbitol 是重要的光合作用產物，也是韌皮部中主要醣類運輸形式 (Gao et al., 2003)，而 Loescher 等人 (1982) 發現當蘋果葉由儲存狀態轉變成供源狀態時，會伴隨 sorbitol dehydrogenase 活性降低與 sorbitol 的含量提升，也發現 sorbitol 的代謝情形在幼葉 與成熟葉片有差異存在，並推測sorbitol 的代謝參與在葉片儲存-供源轉變的調控中 (Loescher et al., 1982)。然而在水稻研究中，卻很少關於 sorbitol 的資訊可供我們參 考鑑定sorbitol transporter 在葉鞘中扮演的功能與角色。

在發育中的穀粒，氮素的累積與醣類的累積一樣重要，根據Mae與Ohira (1981) 的研究，利用¹⁵N標定之ammonium sulfate若被葉身及葉鞘吸收之後，會在生殖生長 期的時候轉運到正在生長的器官中。我們發現水稻-2葉葉鞘中的ammonium trans-porter於抽穗後14天會大量提升表現 (圖九b)，除了葉鞘外 (Chen and Wang,

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2008)，ammonium transporter也會在其他組織表現，例如葉部 (Suenaga et al., 2003) 與根部 (Wang et al., 1993; Kumar et al., 2003; Sonoda et al., 2003)，雖然需要更多實 驗去瞭解ammonium transporter在葉鞘中所扮演之功能，但是這些結果已初步暗示 我們不只是醣類，氮素的運移都可能和葉鞘儲存-供源的轉換有關。

植物利用phosphate transporter從土壤中吸收無機磷 (inorganic Pi) (Smith et al., 2003)，而phosphate transporter於抽穗之後的時期表現量增加 (圖九b)，暗示我們供 源階段的葉鞘也有無機磷的流動，這個結果和Tanaka (1961) 的研究相應證，他們 發現水稻葉鞘中的Pi含量在抽穗期間會改變。

總結來說，對抽穗時期-2 葉葉鞘由儲存組織轉換成供源組織來說，稻穗的抽出 是一個重要的訊息因子。而AGP-L2、GBSSII、SSSI、SBEI、SBEIII、SBEIV、sucrose synthase 與 β-amylase 為-2 葉鞘在儲存-供源轉換期間與澱粉代謝相關之主要標識 基因。蔗糖轉運蛋白OsSUT1、OsSUT4 與 putative sorbitol transporter 可能於供源 時期的葉鞘中，負責運輸醣類到需要的儲藏組織中。除了醣類轉運蛋白，ammonium transporter 與 phosphate transporter 也在葉鞘中扮演重要營養轉運的角色，從供源的 葉鞘將無機磷及氮素傳送出去，這些基因都可以當作葉鞘由儲存組織轉變成供源 組織的重要標識基因。