10.1. 建構 PSUT4 不同長度啟動子穩定性表現載體
將建構完成的 OsSUT4 基因之不同長度啟動子暫時性表現載體以 SacI 與 HindIII 兩限制酵素切下，其中包含啟動子片段、ubi 1st intron、GUS 基因及 3’HVA22 部分，再接到穩定性表現載體 pCambia1302 上，建構好之載體再以 SacI 與 HindIII 作用，確認載體構築完成 (圖二十七)。
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10.2. EHA105 農桿菌勝任細胞之製備與轉型
(1) 從 YEP 固體培養基 (1% bactopeptone、1% yeast extract、0.5% sodium chloride、1.5% agar) 上挑選 EHA105 單一菌落，培養於 3 mL YEP 液體培 養基中 (1% bactopeptone、1% yeast extract、0.5% sodium chloride)。
(2) 於 28℃震盪培養 2 天。
(3) 取 1 mL 菌液加到 50 mL YEP 液體培養基內，於 28℃震盪培養直到 OD600
=0.5~1。
(4) 將菌液倒入事先預冷的離心管中，以 4℃、3,829 x g 離心 7 分鐘。
(5) 除去上清液後加入 200 mL 預冷之無菌水，混合均勻以 4℃、3,829 x g 離心 7 分鐘。
(6) 除去上清液後加入 40 mL 冰冷 10% glycerol，混合均勻以 4℃、1,378 x g 離心20 分鐘。
(7) 去除上清液，加入 3 mL 冰冷 10% glycerol 並混合均勻，以 40 μl 分裝於微 量離心管中，保存於-80℃備用。
(8) 將 EHA105 勝任細胞放置冰上溶解，同時預冷電穿孔專用 cuvette。
(9) 取 2 μL 質體 DNA，加到勝任細胞中並混合均勻。
(10) 將 cuvette 放於 Electroporation Apparatus (Bio-Rad)中，選擇 ”Agro” 模 式，按下 ”pulse”。
(11) 將菌液重新懸浮於 1 mL YEP 液體培養基，於 28℃震盪培養 30-60 分鐘。
(12) 將菌液畫線於含有 50 μg/mL Kanamycin 之 YEP 固體培養基上，於 28℃培 養48 小時。
10.3. 誘導癒傷組織
(1) 收取TNG67水稻乳熟期至糊熟期間的未成熟種子 (約為抽穗後10~15天)，
於室內晾乾後儲藏於4℃冰箱備用。
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(2) 取10-15顆種子去掉內外穎，以消毒水 (2% NaOCl4及一滴Tween-20) 消毒 30分鐘。
(3) 於無菌操作台內以滅菌水沖洗4-5次，完全清除消毒水為止。
(4) 將種子平躺在誘導癒傷組織的CIM固體培養基 (附錄四) 上，以3M透氣膠 帶封邊後，放置27℃全光照培養室培養4-6星期。
(5) 挑取由胚盤衍生出之癒傷組織於新的CIM固體培養皿上，經過2-3星期後，
選取直徑2-5 mm之癒傷組織進行轉殖。
10.4. 水稻基因轉殖 (Hiei et al, 1994; Toki, 1997)
(1) 取轉型成功之農桿菌單ㄧ菌落培養於 3 mL YEP 液體培養基中(含 50 μg/mL
Kanamycine)，在
28℃震盪培養 2-3 天。(2) 取0.5 mL菌液到50 mL AB培養基中 (附錄四) (含50 μg/mL Kanamycine)，於
28℃震盪培養，每隔一段時間測定OD
600數值，直到0.8-1.0為止。
(3) 以4℃、3,840 x g 離心7分鐘後，完全去除上清液，加入10 mL MS液態培 養基 (附錄四)，使菌體懸浮於在培養基中，並倒入petri dish中。
(4) 將水稻癒傷組織完全浸於菌液中，再取出培養於2N6AS 固體培養基中 (附錄四)，在27℃黑暗中共培養2-3 天。
(5) 收集癒傷組織以無菌水清洗3-5次，再以MS培養基清洗3-5次，最後以含有 250 μg/mL Cefotaxime的MS Medium進行洗滌，每小時洗ㄧ次，直到澄淨。
(6) 將癒傷組織移到含有50 μg/mL hygromycin 和 250
μg/mL cefotaxime 的篩
選培養基上，在27℃全光照培養室中培養，約3-6週後可以得到癒傷組織。(7) 將癒傷組織移到PM固體培養基上 (附錄四)，在培養室中處理7-10天。
(8) 將癒傷組織移到RM培養基上 (附錄四)，在27℃全日照培養室中培養3-5 週，即可得到轉殖水稻幼苗。
(9) 將水稻幼苗移至MS固體培養基 (附錄四) 中促進發根。
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(10) 3週後水稻幼苗即可出瓶，待進行馴化後即可種植到盆中。
10.5. GUS 活性染色分析
參考Jefferson (1987) 與 Hu (1990) 的方法，進行 GUS 染色分析
(1) 置入染色液 (0.1 M NaPO4 buffer, pH7.0、10 mM EDTA, pH7.0、0.5 mM potassiumferricyanide 、 0.5 mM potassiumferrocyanide 、 1 mM X-glucuronide、0.1% Triton X-100) 中，經 25 inch-Hg 真空抽氣 10 分鐘後，
於37°C 培養箱 16-24 小時。
(2) 依序以 25%、50%、75%及 95% ethanol 脫去葉綠素後進行觀察。
10.6. 分析轉殖水稻GUS活性
依照上述方法萃取葉鞘蛋白質並利用Bradford dye 測定蛋白質濃度後，取 100 μL 測量 GUS 活性：
(1) 吸取 100 μL 萃取液到微量離心管中，加入 200 μL GUS Assay Buffer 並混合 均勻，於37 ℃培養 20 小時。
(3) 加入 800 μL Carbonate Stop Buffer (0.2M Na2CO3, pH11.2) 終止反應。
(4) 配製 7-hydroxy-4-methylcoumarin (MU) 標準品 (分別含有 0、200、400、
600、800 及 1000 nM 之 MU)。
(5) 分別取 200 μL 標準品及樣品液至微量測試盤之小槽中，使用 Labsystems Fluoroskan Ascent FL (Type374) 螢光測量儀測定螢光強度，再計算出每單 位蛋白質GUS 活性。