參考Nakamura 等人 (1989) 之方法，進行葉鞘蛋白質萃取以進行定量分析 (1) 取 1 g 葉鞘材料，在液態氮下以研缽和杵研磨成粉末，加入 5X 體積萃取液
A (100 mM Tricine-NaOH, pH8、8 mM MgCl2、2 mM ethylenediamine te-tra-acetic acid (EDTA)、50 mM 2-mercaptoethanol、12.5% (v/v) glycerol、5%
(w/v) polyvinylpyrrolidone-40 (PVP-40)) 混合均勻。
(2) 在低溫下以 Miracloth membrane (Calbiochem, USA) 過濾萃取液，收集濾 液。
(3) 以 4℃、10,000 x g 離心 5 分鐘，把沉澱物與上清液分開。
(4) 取 10 μL 上清液進行蛋白質濃度測定後 (Bradford, 1976)，取 30 μg 蛋白質 將體積以萃取液A 補到 100 μL，進行純化步驟。
(a) 加入等體積之 phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1) 混合均勻，以 4℃、13,250 x g 離心 15 分鐘後移除上清液，再重複一次。
(b) 加入 4X 體積冰冷 100% acetone 混合均勻，於-20℃沉澱隔夜或-80℃沉 澱4 小時。
(c) 再分別依序用 200 μL 之 100% methanol、80% acetone 及 100% acetone 清洗沉澱物，每次清洗間隔以4℃、13,250 x g 離心 15 分鐘並丟棄上
25
清液。
(d) 以 4℃、13,250 x g 離心 15 分鐘並移除上清液，再真空抽氣 15 分鐘。
(e) 以 20 μL 1X Sample Buffer (125 mM Tris-HCl, pH6.8、2% SDS、2 mM EDTA、5% β-mercaptoethanol) 及 2 μL Tracking dye (1mg bromophenol blue、5 mL H2O、5 mL glycerol) 溶解蛋白質。
(f) 於 100℃煮沸 5 分鐘後放置冰上 10 分鐘，待冷卻進行 SDS 膠體電泳。
(5) 沈澱物部分 (包含澱粉粒及澱粉粒結合蛋白)
(a) 以 5 mL 萃取液清洗沉澱物兩次，每次以 4℃、10,000 x g 離心 5 分鐘 並去除上清液。
(b) 將沉澱物溶解在 1 mL 的 1X Sample Buffer 中，於沸水中加熱 5 分鐘後 放置冰上10 分鐘。
(c) 以 4℃、15,000 x g 離心 10 分鐘，取 20 μL 上清液加入 2 μL Tracking dye，混合均勻後進行 SDS 膠體電泳。
5.2. 酵素活性分析
5.2.1. 萃取葉鞘蛋白質以進行酵素活性分析
依照上述方法將葉鞘蛋白質萃取出來，亦分成上清液與沉澱物部分:
(1) 上清液部分 (用來測定 AGPase、SSS、SBE、α-amylase 及 β-amylase 之酵 素活性)
(a) 上清液以 4℃、10,000 x g 離心 5 分鐘後，吸取上清液至離心管中。
(b) 加入 4X 體積冰 100% acetone 混合均勻，於-20℃沉澱隔夜或-80℃沉澱 4 小時。
(c) 以 4℃、3,500 x g 離心 15 分鐘，移除上清液。
(d) 加入 1 mL 冰冷 80% acetone 懸浮沉澱物並吸到微量離心管中，再以 4℃、10,000 x g 離心 15 分鐘，移除上清液。
(e) 以 1 mL 萃取液 B (100 mM Tricine-NaOH, pH8、8 mM MgCl2、2 mM EDTA、12.5% (v/v) glycerol、5% (w/v) PVP-40)回溶沉澱物，其為總可
26
溶性蛋白質，取10 μL 依上述方法進行定量，其於儲存在-80℃備用。
(2) 沈澱物部分 (用來測定 GBSS 酵素活性)
(a) 以 5 mL 萃取液 B 清洗沉澱物兩次，每次均以 4℃、10,000 x g 離心 5 分鐘並去除上清液。
(b) 再以 1 mL 萃取液 B 回溶沉澱物，混合均勻後取 50 μL 溶液經抽乾並秤 量乾重，其餘儲存於-80℃備用。
5.2.2. ADP-glucose pyrophosphoylase (AGPase) 活性測定
參考Nakamura 等人 (1989) 之方法，測定葉鞘中 AGPase 酵素活性
(1) 取 200 μL 酵素萃取液，加入 850 μL 反應液 1 (100 mM Hepes-NaOH, pH7.4、5 mM MgCl2、1 mM adenosine 5’-diphosphate glucose (ADPG)、3 mM sodium pyrophosphate、4 mM dithiothreitol (DTT))。
(2) 同時配製體積為 200 μL 之 G1P 標準液 (分別含有 0、0.1、0.2、0.3、0.4、
0.5 μmole G1P)，加入 850 μL 反應液 1。
(3) 於 30℃反應 30 分鐘後，於 100℃加熱 30 秒以終止反應。
(4) 以 4℃、7,840 x g 離心 10 分鐘，取 1 mL 上清液至 1.5 mL 微量離心管中，
加入15 μL10 mM NADP。
(5) 在 340 nm 波長下讀取吸光度為 E1。
(6) 再加入 5 μL 反應液 2 ，內含 0.4 U phosphglucomutase (PGM) [Sigma, USA]
與0.35 U G6PDH [Roche, Germany]，反應 10 分鐘後，在 340 nm 波長下讀 取吸光值作為E2。
(7) 將 E2-E1 之數值帶入 G1P 標準曲線，推算出酵素活性。
5.2.3. Granule-bound starch synthase (GBSS) 活性測定
參考Nishi 等人 (2001) 之方法，測定葉鞘中 GBSS 酵素活性
(1) 取 200 μL 澱粉懸浮液 (含澱粉 5 mg)，加入 200 μL 反應液 1 (50 mM Hepes-NaOH, pH7.4、1.6 mM ADPG、16.7 mM DTT)。
(2) 於 30℃作用 30 分鐘，再以 100℃水浴作用 30 秒終止反應。
27
(3) 配製總體積為 400 μL 之 adenosine 5’-diphosphate (ADP) 標準液 (分別含有 0、0.04、0.08、0.12、0.16 μmole ADP)。
(4) 再加入 100 μL 反應液 2 (50 mM Hepes-NaOH, pH7.4、10 mM phosphocrea-tine (PCr)、200 mM KCl、2 U creatine phosphokinase (CPK)[Sigma, USA])。
(5) 於 30℃作用 30 分鐘，再以 100℃水浴加熱 30 秒終止反應。
(6) 以 4℃、7,840 x g 離心 10 分鐘。
(7) 吸取 400 μL 上清液至新的 1.5 mL 微量離心管，加入 700 μL 反應液 3 (50 mM Hepes-NaOH, pH7.4、20 mM MgCl2、10 mM glucose、2 U G6PDH[Roche, Germany]、2 mM NADP)，混合均勻後，吸取 1 mL 到測光管中。
(8) 於 340 nm 波長下讀取吸光度為 E1。
(9) 加入 5 μL HK (2 U) [Sigma, USA]，反應 5 分鐘後，於 340 nm 波長下讀取 吸光度為E2。
(10) 將 E2-E1 之數值帶入 ADP 標準曲線，推算出酵素活性，所得數值再除上 最初澱粉重。
5.2.4. Soluble starch synthase (SSS) 活性分析
參考Nishi 等人 (2001) 之方法，測定葉鞘中 SSS 酵素活性。
(1) 取 200 μL 酵素萃取液 (至少含粗蛋白 100 μg)，加入 200 μL 反應液 1 (50 mM Hepes-NaOH, pH7.4、1.6 mM ADPG、0.23% (w/v) glycogen、16.7 mM DTT)，於 30℃作用 30 分鐘。
(2) 於 100℃水浴作用 30 秒以終止酵素反應。
(3) 同時配製總體積為 400 μL 之 ADP 標準品 (分別含有 0、0.04、0.08、0.12、
0.16 μmole ADP)。
(4) 樣品和標準品均加入 100 μL 反應液 2 (50 mM Hepes-NaOH, pH7.4、10 mM
PCr、200 mM KCl、2 U CPK[Sigma, USA])。
(5) 於 30℃作用 30 分鐘，再以 100℃水浴加熱 30 秒以終止反應。
(6) 以 4℃、7,840 x g 離心 10 分鐘。
(7) 取 400 μL 上清液至新的微量離心管中，加入 700 μL 反應液 3 (50 mM
28
Hepes-NaOH, pH7.4、20 mM MgCl2、10 mM glucose、2 U G6PDH[Roche, Germany]、2 mM NADP)。
(8) 混合均勻後，吸取 1 mL 到測光管中，於 340 nm 波長下讀取吸光度為 E1。
(9) 再加入 2 U HK[Sigma, USA]，混合均勻並反應 5 分鐘後，於 340 nm 波長 下讀取吸光度為E2。
(10) 將 E2-E1 之數值帶入 ADP 標準曲線，推算出酵素活性。
5.2.5. Starch branching-enzyme (SBE) 酵素活性分析
參考Guan 及 Preiss (1993) 之方法，測定葉鞘中 SBE 酵素活性
(1) 取 200 μL 酵素萃取液兩份 (至少含粗蛋白 100 μg)，一份經過 100℃加熱 5 分鐘變性，作為空白對照組。
(2) 加入 650 μL100 mM Hepes-NaOH (pH7.4) 及 150 μLpotato starch (濃度為 1 mg/ mL)。
(3) 混合均勻並於 30℃作用 30 分鐘後，以 100℃水浴加熱 30 秒以終止反應。
(4) 加入 50 μL 碘液 (0.1% I2、1% KI) 並混合均勻，使樣品顏色變為淡紫色。
(5) 偵測 600 nm 波長下之吸光值，將樣品吸光值扣掉空白對照組後計算活性 (每分鐘增加一個 OD 值為一個活性單位)。
5.2.6. α-amylase 酵素活性分析
參考Megazyme公司的操作手冊 (ALPHA-AMYLASE ASSAY PROCE-DURE-CERALPHA METHOD)，進行α-amylase酵素活性測定 : 以一個阻礙非 還原端被外切酵素 (例如: β-amylase、amyloglucosidase與α-glucosidase) 作用的 反應物 (non-reducing-end blocked p-nitrophenyl maltoheptaoside ; BPNPG7) 來 進行反應，其被α-amylase酵素作用後生成Blocked maltosaccharide與
p-nitrophenyl maltosaccharide，而p-nitrophenyl maltosaccharide再經由
α-glucosidase作用後可生成自由態p-nitrophenyl，偵測p-nitrophenyl在OD410的吸 光度再依照公式換算α-amylase酵素活性。
29
5.2.7. β-amylase 酵素活性分析
參 考Megazyme 公 司 的 操 作 手 冊 (BETA-AMYLASE ASSAY PROCE-DURE-BETAMYL METHOD) ， 進 行 β-amylase 酵 素 活 性 測 定 ： 以 p-nitrophenyl-α-D-maltopentaoside (PNPG5) 當做反應物，其可以被β-amylase快 速水解成maltose及p-nitrophenyl-α-D-maltotrioside，而α-amylase對PNPG5的作 用速度非常慢，p-nitrophenyl-α-D-maltotrioside再經由α-glucosidase作用後可生 成自由態p-nitrophenyl，使用高pH值之Trizma base solution停止反應後，偵測 p-nitrophenyl在OD400的吸光度再依照公式換算β-amylase酵素活性。