水稻葉鞘在抽穗期間由儲存組織轉換成供源組織之 分子調控機制

國立臺灣大學生物資源暨農學院農藝學系 博士論文

Department of Agronomy

College of Bioresources and Agriculture

National Taiwan University Doctoral Dissertation

水稻葉鞘在抽穗期間由儲存組織轉換成供源組織之 分子調控機制

Molecular regulation of sink-source transition in rice leaf sheaths during the heading period

陳懷如 Huai-Ju Chen

指導教授 : 王淑珍 博士 Advisor : Shu-Jen Wang, Ph. D.

中華民國九十八年七月

July, 2009

目 錄

目錄……….…………..1

圖表與附錄目錄……….……..3

縮寫字對照表……….……..5

中文摘要……….…..7

英文摘要……….…..8

前言 1. 水稻葉鞘於抽穗前後期所扮演之角色………..……..…..10

2. 葉片儲存-供源轉換之相關研究……….….11

3. 水稻澱粉合成之相關基因………...12

4. 水稻澱粉分解之相關基因………...….14

5. 澱粉代謝相關基因之影響因子………...15

6. 水稻蔗糖轉運蛋白基因之相關研究………..………...…..16

7. 本論文之試驗架構及意義……….………...….…..….18

材料與方法 1. 植物材料、種植與處理方法……….20

2. 醣類定性與定量分析………..….21

3. 基因表現分析………..….23

4. Microarray 分析………...….24

5. 蛋白質萃取、定量與酵素活性分析……….25

6. ABA 萃取與含量分析………..………30

7. 啟動子釣取及序列分析………..….…32

8. 以暫時性表現系統進行啟動子活性分析…………...………33

9. Electrophoresis Mobility Shift Assay (EMSA) ………..……..………37

10. 以穩定性表現系統進行啟動子活性分析.……….……..………..41

11. 統計分析………...……...…44

結果 1. 葉鞘中澱粉合成、澱粉分解與蔗糖轉運蛋白基因於抽穗期間之表現….……45

1.1. 水稻上位葉葉鞘在抽穗期間其澱粉與可溶性醣類含量變化………45

1.2. 移除幼穗之水稻其葉鞘澱粉含量於抽穗期間之變化………45

1.3. 澱粉合成相關基因在葉鞘儲存-供源轉變期間之表現………...46

1

1.4. α-amylase, β-amylase 及 OsSUTs 基因於葉鞘儲存-供源轉變期間之表現..47

2. 以 Microarray 分析儲存期及供源期葉鞘中之基因表現………....47

3. 探討荷爾蒙是否為調控葉鞘儲存-供源轉換之內在因子……….…...49

3.1. 澱粉合成基因啟動子分析……….…...49

3.2. 荷爾蒙傳導相關轉錄因子-OsDOF3 與 OsWRKY71 在葉鞘中於抽穗期間 之表現分析………..……..….50

3.3. 植物荷爾蒙對切離葉鞘中澱粉含量的影響…...50

3.4. 植物荷爾蒙 ABA 對切離葉鞘中澱粉代謝相關酵素活性及 OsSUTs 基因表 現的影響………...51

3.5. 抽穗期間水稻葉鞘中內生 ABA 含量與澱粉分解酵素活性變化………..52

4. 探討水稻葉鞘於儲存-供源轉換時，調控 OsSUT 基因表現之訊息因子……...52

4.1. 台農 67 水稻之 OsSUT1、2、4 基因之啟動子分子分析……….52

4.2. OsSUT1、2 及 4 基因啟動子於葉鞘中的暫時性表現分析…………...….53

4.3. OsSUT4 基因不同長度啟動子片段之暫時性表現分析………..….55

4.4. OsSUT4 基因之 DF(-550/-484)與 DF(-643/-603)啟動子片段進行 EMSA 分 析...56

4.5. OsSUT4 基因不同長度啟動子之穩定性表現分析………...57

討論 1. 水稻 TNG67 之-2 葉葉鞘為抽穗期間主要澱粉儲存組織……….……...59

2. 稻穗的抽出及其碳源需求調控抽穗後時期葉鞘的供源能力…….………....59

3. 水稻葉鞘儲存-供源轉變之標識基因………..…..60

4. 影響葉鞘中澱粉代謝的內在因子……….63

5. 影響葉鞘中蔗糖轉運蛋白表現的內在因子………...66

6. 調控葉鞘中 OsSUT4 在抽穗後大量表現的啟動子區域.………..68

7. 葉鞘組織暫時性表現系統之建立……….…………70

8. 結語與未來展望……….70

參考資料………..………...……..…..72

2

圖表與附錄目錄

表一、針對澱粉合成、澱粉分解相關基因及蔗糖轉運蛋白設計進行real-time RT-PCR

之專一性引子………...81

表二、水稻-2 葉葉鞘於抽穗期間澱粉合成相關基因表現與澱粉含量變化之相關分 析………...…83

表三、針對 Microarray 所篩選出之基因設計進行 Real-time RT-PCR 或半定量 RT-PCR 之專一性引子……….84

表四、以 real-time RT-PCR 分析由 Microarray 所篩選出基因在抽穗期間之表 現……….………...……...…86

表五、葉鞘澱粉合成主要基因之啟動子序列比對……….…….……….88

表六、設計合成OsSUTs 與 TRXh 基因啟動子之專一性引子………...……89

表七、設計專一性引子，合成5’端 deletion OsSUT4 啟動子之片段與 EMSA 之 DNA 探針……….…90

表八、OsSUT4 基因不同長度啟動子於 TNG67 水稻之轉殖效率….………...…91

表九、OsSUT4 基因啟動子 DF(-550/-484)片段上已知 cis-acting elements…………..92

圖一、水稻葉片及葉環相對位置……….………..93

圖二、水稻上位葉葉鞘在抽穗期間的澱粉含量變化……….….……….94

圖三、水稻抽穗期間-2 葉葉鞘醣類含量變化……….…….……….…95

圖四、正常抽穗與除去幼穗之水稻植株-2 葉葉鞘澱粉變化趨勢……….…..…96

圖五、澱粉代謝相關基因於抽穗前之表現趨勢………...97

圖六、葉鞘中澱粉分解相關基因於抽穗期間之表現……….………..…98

圖七、葉鞘中OsSUTs 基因於葉鞘於抽穗期間之表現………..……..…….99

圖八、葉鞘於儲存及供源時期呈現差異性表現基因之分群與歸類….………100

圖九、葉鞘醣類代謝及分子轉運蛋白相關基因之表現………..…….………..102

圖十、葉鞘中荷爾蒙訊息傳導相關轉錄因子於抽穗期間之表現...103

圖十一、植物荷爾蒙對水稻葉鞘生長及其澱粉含量之影響...104

圖十二、植物荷爾蒙ABA 對水稻葉鞘澱粉合成與分解相關酵素活性之影響….105 圖十三、植物荷爾蒙ABA 對水稻葉鞘中 OsSUTs 基因表現之影響…..………107

圖十四、葉鞘中ABA 含量與澱粉分解酵素活性在抽穗期間的變化………108

圖十五、OsSUT1 基因啟動子序列……….……….…...…….…………109

3

圖十六、OsSUT2 基因啟動子序列………...………….…111

圖十七、OsSUT4 基因啟動子序列………...……….…112

圖十八、TRXh 與 Ubi 啟動子之暫時性表現分析……….………113

圖十九、OsSUT promoter::GUS 暫時性表現質體建構圖 I………..114

圖二十、OsSUT promoter::GUS 暫時性表現質體建構圖 II……..……….115

圖二十一、OsSUT1、2 及 4 啟動子於葉鞘中的暫時性表現分析……….……...116

圖二十二、OsSUT4 promoter::GUS 表現質體建構圖………...………..117

圖二十三、OsSUT4 啟動子 5’-deletion 片段活性分析………….………….…….…118

圖二十四、EMSA 所用 DNA 探針位置………120

圖二十五、OsSUT4 啟動子片段與葉鞘核蛋白之結合分析………...…121

圖二十六、OsSUT4 啟動子片段與葉鞘核蛋白之競爭型結合分析………...122

圖二十七、OsSUT promoter::GUS 穩定性表現質體建構圖………...………123

圖二十八、OsSUT promoter::GUS 質體於轉殖水稻植株之表現………….…....…..124

圖二十九、OsSUT promoter::GUS 質體於轉殖水稻穎花之表現….…….……...…..125

圖三十、OsSUT promoter::GUS 質體於轉殖水稻之啟動子活性分析………….…..126

附錄一、木村氏水耕液配方……….…127

附錄二、水稻肥料施加表……….…128

附錄三、pAHC18 map………..…129

附錄四、水稻基因轉殖各培養機配方………...….…130

4

縮寫對照表

簡 寫 全 名

ABA abscisic acid

ADP adenosine diphosphate ADPG adenosine diphosphate glucose

AGPase ADP-glucose pyrophosphorylase

APS ammonium persulfate

BA N⁶-benzyladenine BAP N⁶-benzylaminopurine

BPNPG7 non-reducing-end blocked p-nitrophenyl maltoheptaoside BSA bovine serum albumin

CPK creatinephosphokinase

DE debranching enzyme

DEPC diethyl pyrophocarbonate DTT dithiothreitol

EDTA athylenediaminetetra acetic acid G1P glucose-1-phosphate

G6PDHase glucose-6-phosphate dehydrogenase GBSS granule-bound starch synthase GUS β-glucuronidase

HK hexokinase

HRP horseradish peroxidase MOPS 3-[N-Morpholino]propanesulfonic acid

MU 7-hydroxy-4-methylcoumarin

MUG 4-methylumbelliferyl

NAA α-naphthaleneacetic acid

NADP β-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate NaOAc sodium acetate

OsSUT Oryza sativa sucrose transporter

PAGE polyacrylamide gel electrophoresis PCR polymerase chain reaction

PCr phosphocreatine PGM phosphglucomutase

5

簡 寫 全 名

PLACE Plant Cis-Acting Regulatory DNA Elements PNP p-nitrophenyl phosphate

PNPG5 p-nitrophenyl-α-D-maltopentaoside

PSUT promoter of sucrose transporter PVP-40 polyvinylpolypyrrolidone-40 SBE starch branching enzyme

SDS sodium dodecyl sulfate SSS soluble starch synthase TBS tris-base buffer saline

TBE tris-borate/ethylenediamine tetra-acetic acid TCA trichloroacetic acid TE tris-EDTA

TEMED tetramethylethylenediamine

TF transcription factor

TRA triethanolamine hydrochloride

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摘 要

水稻上位葉葉鞘為醣類之暫存組織，其在抽穗前會大量累積澱粉，而在抽穗後 其儲存之澱粉會快速分解，並合成蔗糖運送到充實中的穀粒，故在抽穗前後期，

葉鞘將由儲存組織轉變成供源組織，此現象稱之葉鞘儲存-供源轉換。為了瞭解葉 鞘儲存-供源轉換之分子調控機制，本論文以 real-time RT-PCR 分析在水稻抽穗期 間，葉鞘中澱粉合成、澱粉分解與蔗糖轉運蛋白 (sucrose transporter ; OsSUT)等相 關基因之表現變化，結果發現 ADP-glucose pyrophosphorylase large subunit 2、

granule-bound starch synthase II、soluble starch synthase I、starch branching enzyme (SBE) I

、

、

7

Abstract

Upper leaf sheath of rice (Oryza sativa L.) serves as a temporary carbohydrate sink tissue before panicle heading. Starch pre-stored in upper leaf sheaths prior to head- ing would be remobilized to filling grains at post-heading stage. Thus, upper leaf sheaths could be converted to source tissues from sink tissue during heading period. The process of starch changes in leaf sheath is defined as the sink-source transition. The purpose of this project is to reveal the molecular mechanism of the sink-source transi- tion in rice leaf sheaths during heading period. First, the expression profiles of genes involved in starch synthesis pathway were analyzed and compared to starch content in the second leaf sheath below the flag leaf. The results indicated the changes of ADP-glucose pyrophosphorylase large subunit 2 (AGP-L2), granule-bound starch syn- thase II (GBSSII), soluble starch synthase I (SSSI), starch branching enzyme (SBE) I, SBEIII, and SBEIV mRNA levels were highly correlated with starch content changes during the heading period in the leaf sheath, and these starch synthesis-related gene promoters shared several common hormone-responsive elements. In addition, the α-amylase2A and β-amylase were considered as major genes that regulated the starch degradation at the post-heading period. Of the five sucrose transporter (OsSUT) genes, OsSUT1 and OsSUT4 appeared to play an important role in sucrose loading into the phloem of source leaf sheaths. Besides, to reveal whether phytohormones were the fac- tors to control the starch metabolism-related enzyme activities and OsSUTs gene ex- pressions, the effects of GA、ABA and BAP on expressions of these enzymes and genes in detached leaf sheaths were examined. The results indicated that not only the expres- sions of OsSUT1 and 4 but the activities of α-amylase and β-amylase can be enhanced by ABA, suggested that ABA is one of the factors to regulate the carbohydrate metabol-

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ism in leaf sheaths. Since OsSUT4 gene was significantly up-regulated at post-heading stage, it was used as an indicator gene to identify the molecular mechanism of sink-source transition in leaf sheaths. In order to find the cis-acting elements on Os- SUT4 promoter involved in controlling rice leaf sheaths sink-source transition during the heading period, we constructed nine various 5’-deletion OsSUT4 promoter frag- ments containing GUS reporter gene and analyzed the avtivities by particle bombard- ment assay. A 67-bp promoter fragment was identified, which might contain important regulatory elements involved in regulation of OsSUT4 gene up-expression in leaf sheath at post-heading stage.Moreover, microarray analysis was also applied to study the me- chanism of sink-source transition in leaf sheaths during heading period. The data im- plied that the dominant processes associated with functional leaf sheath transition from sink to source were not only carbohydrate metabolism but also the translocation of the nitrogen sources and inorganic phosphate.

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前 言

1. 水稻葉鞘於抽穗前後期所扮演之角色

水稻於穀粒成熟階段，除了穀粒本身合成及蓄積養分的能力外，供源組織能 否提供充足的醣類來源，是決定最終產量的重要因子之一。水稻穀粒充實所需之 醣類的主要供應來源有二 : (一) 生殖生長期，由成熟葉進行光合作用所產生之光 合產物；(二) 於抽穗前即累積在莖部 (葉鞘或莖稈) 的非結構性醣類。水稻莖部累 積之非結構性醣類種類以澱粉為主，其大多分布於莖稈和葉鞘的維管束周圍以及 薄壁組織中，其中以葉鞘薄壁組織為最主要的儲存地點 (Baba and Kisutaka, 1953)。抽穗前兩週，澱粉於上位葉葉鞘中開始累積，約至抽穗時會達到最大量，

而在抽穗之後開始降解。經澱粉分解後所形成之可溶性醣類將轉化形成蔗糖，進 一步運移至發育中之穀粒，以做為穀粒充實所需之碳源 (Perez et al., 1971; Samonte et al., 2001)。水稻葉鞘在抽穗前後期，由儲藏澱粉的儲存組織 (sink tissue) 轉變成 供應醣類的供源組織 (source tissue) 之過程稱為儲存–供源轉變 (sink–source tran- sition)。經¹⁴C 同位素標定分析研究，顯示抽穗前即累積在莖部的醣類約有 68%會 於抽穗後轉運至穀粒，且抽穗前莖部之暫存性醣類的含量與最終穀粒產量呈現絕 對正相關 (Cock and Yoshida, 1972; Ishikawa et al., 1993; Samonte et al., 2001)。此 外，當穀粒充實如遭遇不良生長環境時，莖部於儲存時期 (sink stage) 所累積的醣 類則更顯其重要性。例如當穀粒充實期遇到缺水逆境時，會導致葉片光合作用能 力下降，無法提供穀粒充實所需要之碳源，此時莖稈中α-amylase、β-amylase 及 sucrose phosphate synthase 之酵素活性會提升，促進莖部預先儲藏的澱粉降解及蔗 糖合成，並加快醣類從莖部轉運到穀粒的速度，縮短穀粒充實期，以盡速補充穀 粒充實所需的碳源 (Yang et al., 2001a; Yang et al., 2001b)。因此，預先儲存在莖稈 和葉鞘中的醣類可扮演碳源緩衝者 (buffer) 之重要角色 (Soga and Nozaki, 1957;

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Yoshida, 1972; Blum et al., 1994)，減少環境逆境對穀粒產量所造成的負面影響，進 而避免產量下降。

2. 葉片儲存-供源轉換之相關研究

前人對於植物體儲存–供源轉換的研究大多集中在發育中的葉片上，所有葉片 生長過程都會歷經由儲存狀態轉變到供源狀態的過程。葉片於初發育時，必須依 賴植物體其他部分供給醣類來源 (此時為儲存期)，等到葉片完全展開時，其體內 光合作用效率增加 (Turgeon and Webb, 1975)，直到可以提供本身生長為止。當光 合產物的含量累積到超過本身葉片生長與呼吸作用所需時，葉片必須維持細胞中 醣類的平衡，此時，即轉變成碳源的輸出者 (此時為供源期)。早期利用放射線標 定法觀察發育中葉片的醣類運移與分佈，發現當葉片生長到全部面積的30~60%

時，頂端開始停止碳源的輸入，而葉片的基部仍然持續輸入碳源，證實葉片由頂 端向基部成熟的同時，亦伴隨儲存–供源的轉變由葉片頂端往葉柄方向發生 (Jones and Eagles,1962; Turgeon and Webb, 1975)。早期在探討葉片儲存–供源轉換的研究 時，偏重在未成熟葉片與成熟葉片部分之生理特性或結構上的差異，例如在成熟 的供源期葉片中，碳同化作用增加、氣孔導度增高、可溶性醣類被合成等等 (Turgeon, 1989)。結構上的研究發現菸草葉在儲存期葉片上主要使用較大的葉脈進 行卸載 (unloading) 醣類的工作，而供源期葉片部分則是使用較小的葉脈進行醣類 裝載 (loading) (Ding et al., 1988)。另外，Imlau等人(1999)還發現細胞間連絡絲 (plasmodesmata) 會隨著儲存–供源轉換而由簡單變成具有分支的形態，簡單的細 胞間連絡絲可運載較大分子量的蛋白質，而有分支的細胞間連絡絲相對僅能讓小 分子量的溶質通過，在儲存型的葉片中大部分以簡單型細胞間連絡絲為主，可以 快速補充儲存細胞生長所需的營養物質。Wright等人 (2003) 利用具有供源期專一 表現的阿拉伯芥蔗糖轉運蛋白AtSUC2基因啟動子，於轉殖菸草中探討葉片儲存–

供源轉變的調控機制，證實遮光會影響儲存期葉片轉變成供源期葉片，並推測光

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線或光照下的產物可能會影響葉片儲存-供源之轉換。而植物荷爾蒙也會影響葉片 儲存-供源的轉換，Sokolova等人 (2002) 利用¹⁴C放射線標定蔗糖的流向，觀察BA 對儲存期葉片的影響，發現其會促進週圍蔗糖流入N⁶-benzyladnine (BA) 處理的葉 片部分，增強積儲的能力。而若是將Gibberellic acid (GA) 處理在供源時期的蠶豆 葉片上，則會促進¹⁴C-sucrose由供源期葉片輸出 (Aloni et al., 1986)。同一葉片上儲 存期部分與供源期部分的內生荷爾蒙含量也不相同，Thorsteinsson等人 (1990) 偵 測發育中白樺樹葉片上的Abiscisic acid (ABA) 與Indoleacetic acid (IAA) 含量，發 現在儲存期的葉片部分，相較於供源期葉片部分，具有較高的ABA含量及較低的 IAA含量，暗示ABA與IAA參與在葉片發育的調控上。

3. 水稻澱粉合成之相關基因

水稻葉鞘由儲存組織轉變為供源組織之過程，可依醣類的代謝變化分成三個 階段：(一) 澱粉合成期，葉鞘於抽穗前會大量累積澱粉；(二) 澱粉降解期，抽穗 之後原本儲存於葉鞘中的澱粉開始降解，以形成可溶性醣類；(三) 蔗糖轉運期，

重新合成之蔗糖於此時期開始運移至穀粒中。

抽穗前，大量累積澱粉之階段，一般來說，有三大類酵素參與植物體中澱粉 的合成過程: ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase)、starch synthase (SS)及 starch-branching enzyme (SBE)。AGPase 催化澱粉合成速度的決定步驟，主要負責 glucose-1-phosphate (G1P) 與 adenosine 5＇-triphosphate (ATP) 之反應，形成 ADP-glucose (ADPG)，而 ADPG 為合成澱粉之基質 (substrate)。植物的 AGPase 是 由兩個大次單元 (large subunit) 及兩個小次單元 (small subunit) 所組成的異型四 聚物 (heterotetramers)。AGPase 具有許多調控特性，大部分植物的 AGPase 會受到 3-phosphoglyceric acid (3-PGA) 的活化，而受到 phosphate (Pi) 抑制 (Ghosh and Preiss, 1966； Sikka et al., 2001)，但不同組織間的 AGPase 對 3-PGA/Pi 之敏感度並 不同，例如水稻發育中種子之AGPase 活性，相較於葉片中的 AGPase，其對 3-PGA

12

及Pi 具有較高的敏感度 (Sikka et al., 2001)。目前發現水稻中有兩個小次單元 AGPase 基因: AGP-S1 及 AGP-S2 與四個大次單元 AGPase 基因: AGP-L1、AGP-L2、

AGP-L3 及 AGP-L4，而由 cDNA database 的搜尋結果顯示 AGP-S2 基因有兩個轉錄 產物，分別命名為AGP-S2a 與 AGP-S2b。Lee 等人 (2007) 利用 AGP::GFP 融合蛋 白技術偵測這些AGPase 蛋白於細胞中的分佈位置，發現 AGP-S2b 與 AGP-L1 (AGP-L2；Lee et al., 2007) 是屬於細胞質中的 AGPase，而其他四個 AGPase 則位 於葉綠體或澱粉體中。水稻葉身主要表現之AGPase 基因為 AGP-S2a 與 AGP-L3，

葉鞘則以AGP-S1 與 AGP-L2 為主，而 AGP-L1、AGP-L2、AGP-S1 及 AGP-S2b 等 基因則於水稻胚乳中大量表現 (Hirose et al., 2006； Lee et al., 2007)。

Starch synthase 可依其在葉綠體或澱粉體中的位置而區分成兩種，一種是可與 澱粉粒結合之granule-bound starch synthase (GBSS)，另一種則是存在於基質 (stroma) 中的 soluble starch synthase (SSS)。GBSS 負責直鏈澱粉 (Amylose) 的延 長，水稻中已發現兩個GBSS isoforms: GBSSI 及 GBSSII，GBSSI 主要在儲藏組織 (storage tissue) 中進行澱粉的合成 (Smith et al., 1997)，例如在缺少 GBSSI 的 waxy 水稻中，胚乳中的澱粉粒即缺乏直鏈澱粉，但在其他器官和組織中的澱粉粒仍然 含有直鏈澱粉 (Blakeney and Matheson, 1984)，而較晚被發現的 GBSSII 則在非儲 藏性組織 (nonstorage tissue) 中負責澱粉之合成 (Vrinten and Nakamura, 2000)。關 於SSS，其功能為延長支鏈澱粉 (Amylopectin)，目前水稻中有四個 SSS isoforms:

SSSI、SSSII、SSSIII 及 SSSIV，除了 SSSI 以外，其他 isoforms 均具有兩個以上 isogenes，形成一個基因家族 (gene family)。不同 SSS isoform 負責產生不同長度的 支鏈，例如SSSI 偏好支鏈的聚合程度 (degree of polymerization, DP) 為 DP8-12 (Nakamura, 2002)，而 Edwards 等人 (1999) 利用馬鈴薯表現反義 SSSIII，證明 SSSIII 偏好合成DP25-35 的支鏈。

SBE 負責之功能為在直鏈或支鏈澱粉上生成 α(1→6)糖苷鍵連接的支鏈，水稻 中已經發現有SBEI、III 與 IV 三種 isoforms。植物中的 SBE 可依胺基酸序列的相

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似度區分成家族A (family A) 及 B (family B) (Burton et al., 1995)，家族 A 的 SBE 胺基酸序列的N 端處比家族 B 多了 60-100 個胺基酸，但是在 C 端則缺少 50 個胺 基酸，其中包含了水稻的SBEIII 和 SBEIV、玉米的 SBEII 及豌豆的 SBEI，而水稻 的SBEI、玉米的 SBEI 及豌豆的 SBEII 則屬於家族 B。兩家族中的 SBE 對基質 (substrate) 的偏好程度及轉移的支鏈長度都有所不同，例如玉米的 SBEI 對直鏈澱 粉的親和性較高，而玉米的SBEII 則較偏好於支鏈澱粉上加上支鏈 (Guan and Preiss, 1993)。

4. 水稻澱粉分解之相關基因

水稻抽穗之後，上位葉葉鞘中澱粉分解的代謝反應開始進行。在植物體營養 器官中負責澱粉分解之酵素可歸納成下列幾步驟：(一) 由澱粉粒分解成直鏈水溶 性葡聚醣 (soluble glucans)，負責的酵素有α-amylase 及 debranching enzyme (DBE)。α-amylase 是作用在 glucosyl bonds 的內切酶，澱粉粒的表面結晶結構會先 被α-amylsae 分解成具有分支 (branched) 和直鏈 (linear) 的水溶性葡聚醣，目前已 知水稻中有十個α-amylase isogenes，而主要表現在葉部組織的有 α-amylase1A, 2A, 3D and 3E 四個 isogenes (Thomas et al., 1994)。DBE 負責作用切斷葡聚醣分子之 α(1-6)糖苷鍵的鍵結部分，使支鏈葡聚醣轉變成直鏈葡聚醣後，再供其他澱粉分解 酵素繼續作用。DBE 可與 SBE 一起決定支鏈澱粉的分支程度，故 DBE 也可以參 與在澱粉合成的反應中。已經發現植物體中有四種DBE 酵素: pullulanase (PUL)、

isoamylase 1 (ISA1)、ISA2 及 ISA3 (Nakamura, 1996)。在水稻種子成熟的階段，可 偵測到高表現量的PUL 與 ISA1 基因，而在水稻葉身則以 ISA3 基因表現量最高 (Ohdan et al., 2005)。以阿拉伯芥突變株實驗證實 ISA1 與 ISA2 並不參與葉片澱粉的 分解，但是會使澱粉的合成過程不正常 (Zeeman et al., 1998)，而 ISA3 突變株會使 夜晚中葉片的澱粉含量變高；(二) 直鏈水溶性葡聚醣有兩種代謝路徑，一個稱做 phosphorolytic pathway，是藉由葉綠體中的 α-glucan phosphorylase (AtPHS1; Pho1)

14

催化直鏈葡聚醣的非還原端，釋放出glucose-1-phosphate (G1P)。另一途徑稱做 hydrolytic pathway，主要提供輸出葉綠體的醣類來源，是藉由 β-amylase 切斷葡萄 糖聚合分子的α(1→4)糖苷鍵，且作用位置由澱粉非還原端處開始進行酵素反應，

將直鏈葡聚醣分解成maltose (Lao et al., 1999)，經由位於葉綠體內膜上的 maltose transporter (MEX1) 運送到細胞質中 (Nittylä et al., 2004)。種子中的β-amylase 在萌 芽前即存在於胚乳中，經蛋白酶作用移去C 端的部分胺基酸片段後，即會從不活 化狀態 (inactive form) 轉變成具有活性之酵素 (active form)。進一步利用阿拉伯芥 突變株的實驗顯示，植物中經由β-amylase 分解直鏈葡聚醣之 hydrolytic pathway 較phosphorolytic pathway 重要；(三)由α-amylase 與β-amylase 作用後之產物:

maltose、短鏈 glucans、maltosaccharides 或 limit dextrins 等，均可由α-glucosidase 分解成葡萄糖。

5. 澱粉代謝相關基因之影響因子

目前已知澱粉代謝相關基因在其他組織會受到一些訊息分子的調控：(一) Scheible 等人 (1997)曾經在菸草中發現硝酸 (nitrate) 可以藉由降低 3-PGA 的濃度 及抑制小次單元AGPase 之基因表現而調控澱粉合成；(二) 阿拉伯芥 AGPase (Sokolov et al., 1998)、甘藷 GBSSI (Wang et al., 2001)、馬鈴薯 AGPase、GBSSI、

SSSII、SSSIII (Visser et al., 1991; Nakata and Okita, 1995; Kossmann et al., 1999)、樹 薯SBE (Salehuzzaman et al., 1994)、水稻

α

、 α

、 α

1999; Itoh et al., 1995; Rook et al. 2001, Akihiro et al. 2005; Wang et al. 2006)，而目前 仍然未知這些訊息分子是否也於葉鞘中影響醣類代謝相關基因之表現，進而控制 葉鞘儲存–供源的轉變。

15

6. 水稻蔗糖轉運蛋白基因之相關研究

葉鞘中的澱粉分解後，需重新合成可運移的醣類，而蔗糖為植物體中不同組 織間醣類運輸的主要形式，其藉由韌皮部進行長距離的運送。蔗糖在葉肉細胞合 成之後，可以經由兩種途徑進入韌皮部之篩管或伴細胞：(一) 藉由蔗糖轉運蛋白 (H⁺/sucrose transporter；SUT)經 apoplastic pathway 進入 sieve element-companion cell (SE-CC)；(二) 藉由細胞間連絡絲 (plasmodesmata)經 symplastic pathway 進入到 SE-CC 中。蔗糖轉運蛋白對於植物組織間碳源的分配佔有重要的角色，若以反義 股基因 (antisense gene) 或 RNA 干擾 (RNAi) 轉殖方式抑制細胞內蔗糖轉運蛋白 的表現，則會顯著影響植物體醣類運輸情形及其相關生理反應 (Kühn et al.,

1996

2003

high-affinity/low-capacity 的轉運蛋白 (Km=139 μM-1.5 mM)，而 TypeⅢ轉運蛋白則 具low-affinity/high-capacity (Km=5-6 mM)的特性。TypeⅡ的成員在胺基酸序列上 和其他兩群有很大的差異，其具有較長的N 端 (N-terminal) 及中心環圈 (central loop)。隨著被發現的 SUT 基因增多，Sauer (2007)重新分析已知 SUT 基因的演化關 係，將其分成四條進化分支，原先Aoki 等 (2003) 所提出之 TypeⅡsubfamily 被進 一步分成兩群。Braun 等人 (2009) 更加入了高粱、玉米及二穗短柄草等禾本科植 物的SUT 基因來進行分群，依照序列同源性分成五群，原先的 Type I subfamily 屬 於 Group 2，只包含雙子葉植物的 SUT 基因；而 TypeⅡsubfamily 則分別分成 Group 1、5、3 三群，前兩群只具有單子葉植物之 SUT 基因，而 Group 3 與 Group 4 (早 期的Type Ⅲ) 則均包含單子葉及雙子葉的 SUT 基因。

Hirose 等人 (1997) 篩選出水稻第一個 SUT 基因，稱之為 OsSUT1，亦為單子 葉植物中第一個被篩選到的SUT 基因。Aoki 等人 (2003) 利用水稻 OsSUT1 及大 麥HvSUT2 的基因序列比對找到水稻另外四條 SUT 基因，分別命名為 OsSUT2

、

、

16

4 及 5。OsSUT1 屬於 Group 1 轉運蛋白，也是目前被研究較為詳盡的水稻轉運蛋 白，在發育中的穀粒，OsSUT1 主要表現在發育的中後期。在細胞層次的位置上，

OsSUT1 已經被證實表現在母系珠心突出處 (maternal nucellur projection)、珠心表 皮細胞 (nucellur epidermis) 及糊粉層組織 (aleurone tissue)，其可能參與母系細胞 的蔗糖進出及糊粉層細胞的蔗糖吸收過程。OsSUT1 也會在胚組織、葉鞘及莖稈韌 皮部的伴細胞表現 (Hirose et al., 1997; Matsukura et al., 2000; Furbank et al., 2001;

Aoki et al., 2003)，推測其可能做為上述組織中的韌皮部裝載者 (phloem loader) (Furbank et al., 2001)。

OsSUT2 屬於 Group 4 轉運蛋白的一員，其基因之功能及生理特性到目前為止 仍然不清楚。已知其他同屬於Group 4 之 HvSUT2、AtSUT4 (Endler et al., 2006) 及 LjSUT4 轉運蛋白位於細胞液胞膜上，推測具有交換細胞質與液胞間蔗糖的功能。

但並非所有的Group 4 轉運蛋白均位於液胞膜上，例如馬鈴薯之 StSUT4 即是表現 在葉片細胞膜及核周圍的內膜上 (endomembranes) (Chincinska et al., 2008)。

OsSUT3 與 OsSUT1 同屬 Group 1，其大量表現在發育中的花粉，推測其可能 參與在蔗糖運移至花粉的途徑中 (Takeda et al., 2001; Ngampanya et al., 2002)。

OsSUT3 也被發現在發芽中的種子、幼根、節間、儲源及供源時期的葉身與葉鞘等 組織中表現 (Aoki et al., 2003; Scofield et al., 2007)。

OsSUT4 及 OsSUT5 分別屬於 Group 3 及 Group 5 的族群，此兩群蔗糖轉運蛋 白之功能尚未清楚，僅知此兩基因在所有水稻組織均有表現 (Aoki et al., 2003)。早 期依Group 3 中發現之基因序列特性及其缺乏轉運活性的特點，推測其扮演感應蔗 糖之功能 (Barker et al., 2000)，但近期研究則指出仍有許多 Group 3 SUT 基因可轉 譯出具有轉運功能之蔗糖轉運蛋白 (Meyer et al., 2000)。

若藉由探討水稻葉鞘中醣類在抽穗前後的合成、分解及轉運之代謝路徑，將有 助於瞭解其葉鞘儲存–供源轉換的調控機制。然而大部分的醣類代謝酵素都是由多 基因家族轉譯出來的，同一個基因家族中之不同基因可能具有發育時期之表現與

17

組織專一性的差異，如果可以界定出每一個酵素中基因層次上的貢獻，找出主要 調控基因及其調控因子，將會有助於了解水稻葉鞘在抽穗期間其澱粉代謝與蔗糖 轉運的調控機制。

7. 本論文之試驗架構及意義

為了瞭解水稻葉鞘於抽穗期間儲存–供源轉換的分子調控機制，本論文主要 以下列幾種策略進行研究：(一) 首先利用 real-time RT-PCR 技術，分析葉鞘中澱粉 合成、澱粉分解與蔗糖轉運蛋白相關之各種isogene 於抽穗期間的表現變化，篩選 可能參與水稻葉鞘儲存–供源轉換時期之關鍵基因；(二) 除了澱粉代謝與蔗糖轉 運外，還藉由microarray 技術，進行篩選葉鞘中在抽穗前後有差異性表現的基因，

以期能更了解葉鞘儲存–供源轉換時期之其他生理代謝途徑；(三) 藉由荷爾蒙處 理水稻切離葉鞘實驗，探討植物荷爾蒙是否可能參與葉鞘中於抽穗期間的醣類代 謝調控；(四) 選擇一個葉鞘儲存-供源轉變的標識基因 (OsSUT4)，藉由其不同長 度啟動子片段活性分析，鑑定出調控此基因於抽穗前後出現差異性表現之啟動子 調控區域。預期在我們的研究策略下，能更了解水稻葉鞘於抽穗期間儲存–供源轉 換之分子調控機制。

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材料與方法

1. 植物材料、種植與處理方法 1.1. 植物材料

由高雄改良場提供之九十四年第二期台農六十七號水稻種子 (Oryza sativa L.

cv Tainung 67; TNG67)

1.2. 種子消毒及發芽

(1) 將 TNG67 水稻種子以 1% (v/v) NaOCl4消毒 30 分鐘並以蒸餾水沖洗 4-5 次，放置在鋪有濕潤擦手紙之玻璃培養皿中。

(2) 於 37℃培養箱中黑暗培養 2 天。

(3) 第三天時將種子移到水耕杯中，約 3-4 天更換一次木村氏水耕液 (Chu and Lee, 1989) (附錄一)，於 30/25℃(日溫/夜溫)玻璃光照室中生長兩星期。

(4) 將三葉齡大的幼苗移到含有培植土的長方盆中 (長/寬/高=62/36/24 公分)，

每盆種植 15 株水稻幼苗或是方形盆中 (長/寬/高=20/20/27 公分)，每盆種 植4 株。

(5) 於水稻幼苗移盆時添加基肥，分別於移盆一個月及兩個月時施加追肥 (附 錄二)。

1.3. 於抽穗前估計抽穗時間之方法

利用劍葉葉環和劍葉底下第一葉 (-1 葉) 的葉環距離 (圖一) 來判斷抽穗 前的天數 (Matsuzaki and Rutger, 1991)，TNG67 水稻於夏季生長時，兩葉葉環 距離為-4±1、0、4±1 及 9±1 公分時，分別代表植株生長階段為抽穗前 20、15、

10 和 5 天。於冬季生長的植株，兩葉葉環距離為-4±1、0 及 4±1 公分時，分別 代表植株狀態為抽穗前15、10 和 5 天 (圖一)。

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1.4. 切離葉鞘處理荷爾蒙之方法

(1) 分 別 配 製 100 mM ABA [Sigma, Canada] 、

GA

及

(2) 將水稻-2 葉葉片以上部分從節點下端約 5 公分處切下，慢慢抽離-1 葉葉片 以上部分，僅剩下-2 葉葉片並浸泡於荷爾蒙處理液中。

(3) 放置在 25℃/20℃(日溫/夜溫)之自然光照室，培養 24 小時後，測量葉身及 葉鞘長度變化量後，去掉葉身及節以下部分，液態氮急速冷凍後，儲存於 -80℃冰箱中備用。

1.5. 基因槍射擊之材料處理

將儲存時期與供源期的水稻-2 葉葉鞘由植株上切離下來，以節點為起點，

取出6 公分長度的葉鞘，將之分割成 1 X 0.3~0.5 大小的片狀後，以內面朝上 平鋪在不含蔗糖的MS 培養基上 (附錄四)，並緊密整齊排列在培養皿中間。

2. 醣類定性與定量分析 2.1. 澱粉碘染觀察

將儲存期及供源期的水稻-2 葉葉鞘從植株上分離下來，利用徒手切片方式 橫切葉鞘底部，再以I2/KI (0.6 g/6 g) 染色 30 秒，以擦手紙吸去過多的碘液後，

放置光學顯微鏡下觀察。

2.2. 以酵素法測定澱粉含量

參考Keppler 與 Decker (1974) 方法進行澱粉含量測定

(1) 用研缽和杵在液態氮下將葉鞘研磨成粉末，於 80℃烘乾 12 小時後，測量 其乾重。

21

(2) 以 5 mL 之 80% (v/v) ethanol 於 80℃水浴中萃取 5 分鐘，除去可溶性醣類。

(3) 以 4℃、3,000 x g 離心 10 分鐘後，小心移除 ethanol (重複步驟 2-3 二次)。

(4) 於抽氣機中抽乾上清液。

(5) 用 3 mL 滅菌水將沉澱物懸浮起來，並在 100℃水浴作用 2 小時。

(6) 配製濃度為 5 mg/mL 之澱粉溶液一起進行糊化，並製作標準曲線 (分別含 50、100、150、200 與 250 μg 之澱粉)。

(7) 取 50 μL 樣品與澱粉標準品，加入 150 μL 酵素反應液 (1.2 U amylogluco- sidase [Sigma, USA]、0.15 U pullulanase [Sigma, Israel])，於 55℃作用 1.5 小時。

(8) 再於 100℃作用 5 分鐘，使酵素失去活性。

(9) 以 4℃、7,840 x g 離心 10 分鐘後，吸取 0.1 mL 上清液於測光管中。

(10) 加入 1 mL TRA buffer (0.3 M triethanolamine hydrochloride、4.05 mM MgSO4, pH7.5)，內含 0.65 mg ATP、0.952 mg β-nicotinamide adenine di- nucleotide phosphate (NADP)及 5 μL glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDHase)[Roche, Germany]，混合均勻後，測定 OD365數值為E1。

(11) 加入 5 μL TRA buffer，內含 0.3 U hexokinase (HK) [Sigma, USA]，混合均 勻後反應30 分鐘，測定 OD365數值為E2。

(12) 利用 E2-E1 之數值對照澱粉標準曲線計算出澱粉含量。

2.3. 以酵素法測定蔗糖與葡萄糖含量

參考Nakamura (1989) 等人方法進行蔗糖與葡萄糖含量測定

(1) 用液態氮將水稻葉鞘研磨成粉末，於 80℃烘乾 12 小時後測量其乾重。

(2) 加入 4 mL 80% (v/v) ethanol，於 80℃水浴作用 5 分鐘，溶解出可溶性醣類。

(3) 以 4℃、3,000 x g 離心 10 分鐘，收集上清液後重複步驟 2-3 二次，將上清 液體積補到10 mL。

22

(4) 取 0.1 mL 上清液兩份，於真空抽氣機抽乾。

(5) 一管加入 0.4 mL 0.1 M acetate buffer (pH4.6)，另一管加入 0.3 mL acetate buffer 及 0.1 mL invertase solution (20 mg/mL in acetate buffer, pH4.6)，於 55℃作用 1 小時。

(6) 再於 100℃作用 5 分鐘，使酵素失去活性。

(7) 以 4℃、7,840 x g 離心 10 分鐘，吸取 0.1 mL 上清液到測光管中。

(8) 配製體積為 0.1 mL 之葡萄糖標準曲線 (分別含有 0、10、20、30、40 及 50 μg 葡萄糖)。

(9) 將上清液及標準液加入 1 mL TRA buffer，內含 0.65 mg ATP、0.952 mg NADP 及 6.6 U G6PDHase，混合均勻後，測定 OD365數值為E1。

(10) 加入 5 μL TRA buffer，內含 0.3 U HK，混合均勻反應 30 分鐘，測定 OD365

數值為E2。

(11) 利用 E2-E1 的數值對照標準曲線算出葡萄糖含量。

(12) 未加 invertase 的樣品可計算出本身葡萄糖含量，將有加 invertase 及未加 invertase 的量相減，可得到經由轉化的葡萄糖含量，利用相同莫耳數計算 蔗糖含量。(Glucose wt= 180.16, Sucrose wt= 342.29 )

3. 基因表現分析 3.1. 葉鞘總 RNA 萃取

以Trizol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA)抽取水稻葉鞘總 RNA 後，利用 TURBO DNA-free^TM kit (Ambion, USA)去除殘存的基因組 DNA。

3.2. 即時反轉錄聚合酶連鎖反應 (Real-time RT-PCR)

使用Brilliant^® SYBR^® Green QRT-PCR Master Mix Kit (Stratagene, USA)，

並以Stratagene MX3000P^TM機器進行即時反轉錄聚合酶連鎖反應，所得結果利

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用MxPro QPCR Version 3.00 軟體進行分析。針對即時反轉錄聚合酶連鎖反應 對目標基因設計專一性引子 (表一)，並於適當的黏合溫度下進行片段的擴 增。Real-time RT-PCR 反應以總體積 25 μL 進行 (200 ng RNA template, 1X master mix、0.1-0.5 μM forward primer、0.1-0.5 μM reverse primer、30 nM ref- erence dye、1 μL StrataScript RT/RNase Block Enzyme Mixture)，程序條件如下:

50℃反轉錄 30 分鐘，接著以 95℃反應 10 分鐘，然後進入 40 個循環的 PCR 反應，每一個循環的溫度為 95℃/1 分鐘，適當的黏合溫度/1 分鐘，72℃/1 分 鐘。分析基因表現時，以Actin 或 Ubiqutin 基因做為 internal control，利用 Ct 值計算出相對表現量(Relative quantitation)，計算方式如下所示:

Target gene/Actin = 2 (Ct Actin – Ct Target gene) = 2^-△△Ct

4. Microarray 分析

(1) 抽取抽穗前 10 天及抽穗後 5 天-2 葉葉鞘總 RNA，分別當作儲存時期及供 源時期樣品，送基因數碼科技股份有限公司進行Microarray 分析，步驟如 下。

(2) 總 RNA 樣品 (1 μg) 經過 DNase I 酵素處理後，以 MessageAmp aRNA kit (Ambion, Austin, TX) 合成 cDNA。

(3) 將儲存時期 RNA 標定螢光物質 Cy3，而供源時期 RNA 標定螢光物質 Cy5。

(4) 依照Oligonucleotide Microarray Hybridization protocol方式，以包含20,000 條寡核甘酸的Rice Oligo Microarray晶片 (Agilent Technologies, USA) 與 標定螢光物質的cDNA進行雜合反應。

(5) 所得到數據以 GenePix4000B scanner 及 GenePix Pro 5.1 software 進行結果 掃描和分析。

(6) 基因表現差異依照供源時期樣品和儲存時期樣品之螢光比值 (Cy5/Cy3) 來定義，當Cy5/Cy3 比值大於 1 時，表示此基因在供源時期是提高表現；

24

而當比值小於1 時，表示此基因在供源時期是降低表現。

(7) 挑選出 Microarray 晶片上 Actin 及 G6PDHase 基因做為對照組基因，其中 有16 個 Actin 基因其 source 比 sink 時期比值為 0.6 到 1.9；有 5 個 G6PDHase 基因比值從0.7 到 1.3。

(8) 挑選螢光比值超過三倍的基因 (Cy5/Cy3 大於 3 及小於 1/3) 當作兩個時期 有差異性表現的基因，並依照其功能進行分類。

(9) 選出 30 個基因並設計專一性引子 (表三)，收取抽穗期間-2 葉葉鞘材料，

進行real-time RT-PCR 分析，確認所挑取基因之表現情形。

5. 蛋白質萃取、定量與酵素活性分析 5.1. 萃取葉鞘蛋白質以進行電泳分析

參考Nakamura 等人 (1989) 之方法，進行葉鞘蛋白質萃取以進行定量分析 (1) 取 1 g 葉鞘材料，在液態氮下以研缽和杵研磨成粉末，加入 5X 體積萃取液

A (100 mM Tricine-NaOH, pH8、8 mM MgCl2、2 mM ethylenediamine te- tra-acetic acid (EDTA)、50 mM 2-mercaptoethanol、12.5% (v/v) glycerol、5%

(w/v) polyvinylpyrrolidone-40 (PVP-40)) 混合均勻。

(2) 在低溫下以 Miracloth membrane (Calbiochem, USA) 過濾萃取液，收集濾 液。

(3) 以 4℃、10,000 x g 離心 5 分鐘，把沉澱物與上清液分開。

(4) 取 10 μL 上清液進行蛋白質濃度測定後 (Bradford, 1976)，取 30 μg 蛋白質 將體積以萃取液A 補到 100 μL，進行純化步驟。

(a) 加入等體積之 phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1) 混合均勻，以 4℃、13,250 x g 離心 15 分鐘後移除上清液，再重複一次。

(b) 加入 4X 體積冰冷 100% acetone 混合均勻，於-20℃沉澱隔夜或-80℃沉 澱4 小時。

(c) 再分別依序用 200 μL 之 100% methanol、80% acetone 及 100% acetone 清洗沉澱物，每次清洗間隔以4℃、13,250 x g 離心 15 分鐘並丟棄上

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清液。

(d) 以 4℃、13,250 x g 離心 15 分鐘並移除上清液，再真空抽氣 15 分鐘。

(e) 以 20 μL 1X Sample Buffer (125 mM Tris-HCl, pH6.8、2% SDS、2 mM EDTA、5% β-mercaptoethanol) 及 2 μL Tracking dye (1mg bromophenol blue、5 mL H2O、5 mL glycerol) 溶解蛋白質。

(f) 於 100℃煮沸 5 分鐘後放置冰上 10 分鐘，待冷卻進行 SDS 膠體電泳。

(5) 沈澱物部分 (包含澱粉粒及澱粉粒結合蛋白)

(a) 以 5 mL 萃取液清洗沉澱物兩次，每次以 4℃、10,000 x g 離心 5 分鐘 並去除上清液。

(b) 將沉澱物溶解在 1 mL 的 1X Sample Buffer 中，於沸水中加熱 5 分鐘後 放置冰上10 分鐘。

(c) 以 4℃、15,000 x g 離心 10 分鐘，取 20 μL 上清液加入 2 μL Tracking dye，混合均勻後進行 SDS 膠體電泳。

5.2. 酵素活性分析

5.2.1. 萃取葉鞘蛋白質以進行酵素活性分析

依照上述方法將葉鞘蛋白質萃取出來，亦分成上清液與沉澱物部分:

(1) 上清液部分 (用來測定 AGPase、SSS、SBE、α-amylase 及 β-amylase 之酵 素活性)

(a) 上清液以 4℃、10,000 x g 離心 5 分鐘後，吸取上清液至離心管中。

(b) 加入 4X 體積冰 100% acetone 混合均勻，於-20℃沉澱隔夜或-80℃沉澱 4 小時。

(c) 以 4℃、3,500 x g 離心 15 分鐘，移除上清液。

(d) 加入 1 mL 冰冷 80% acetone 懸浮沉澱物並吸到微量離心管中，再以 4℃、10,000 x g 離心 15 分鐘，移除上清液。

(e) 以 1 mL 萃取液 B (100 mM Tricine-NaOH, pH8、8 mM MgCl2、2 mM EDTA、12.5% (v/v) glycerol、5% (w/v) PVP-40)回溶沉澱物，其為總可

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溶性蛋白質，取10 μL 依上述方法進行定量，其於儲存在-80℃備用。

(2) 沈澱物部分 (用來測定 GBSS 酵素活性)

(a) 以 5 mL 萃取液 B 清洗沉澱物兩次，每次均以 4℃、10,000 x g 離心 5 分鐘並去除上清液。

(b) 再以 1 mL 萃取液 B 回溶沉澱物，混合均勻後取 50 μL 溶液經抽乾並秤 量乾重，其餘儲存於-80℃備用。

5.2.2. ADP-glucose pyrophosphoylase (AGPase) 活性測定

參考Nakamura 等人 (1989) 之方法，測定葉鞘中 AGPase 酵素活性

(1) 取 200 μL 酵素萃取液，加入 850 μL 反應液 1 (100 mM Hepes-NaOH, pH7.4、5 mM MgCl2、1 mM adenosine 5’-diphosphate glucose (ADPG)、3 mM sodium pyrophosphate、4 mM dithiothreitol (DTT))。

(2) 同時配製體積為 200 μL 之 G1P 標準液 (分別含有 0、0.1、0.2、0.3、0.4、

0.5 μmole G1P)，加入 850 μL 反應液 1。

(3) 於 30℃反應 30 分鐘後，於 100℃加熱 30 秒以終止反應。

(4) 以 4℃、7,840 x g 離心 10 分鐘，取 1 mL 上清液至 1.5 mL 微量離心管中，

加入15 μL10 mM NADP。

(5) 在 340 nm 波長下讀取吸光度為 E1。

(6) 再加入 5 μL 反應液 2 ，內含 0.4 U phosphglucomutase (PGM) [Sigma, USA]

與0.35 U G6PDH [Roche, Germany]，反應 10 分鐘後，在 340 nm 波長下讀 取吸光值作為E2。

(7) 將 E2-E1 之數值帶入 G1P 標準曲線，推算出酵素活性。

5.2.3. Granule-bound starch synthase (GBSS) 活性測定

參考Nishi 等人 (2001) 之方法，測定葉鞘中 GBSS 酵素活性

(1) 取 200 μL 澱粉懸浮液 (含澱粉 5 mg)，加入 200 μL 反應液 1 (50 mM Hepes-NaOH, pH7.4、1.6 mM ADPG、16.7 mM DTT)。

(2) 於 30℃作用 30 分鐘，再以 100℃水浴作用 30 秒終止反應。

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(3) 配製總體積為 400 μL 之 adenosine 5’-diphosphate (ADP) 標準液 (分別含有 0、0.04、0.08、0.12、0.16 μmole ADP)。

(4) 再加入 100 μL 反應液 2 (50 mM Hepes-NaOH, pH7.4、10 mM phosphocrea- tine (PCr)、200 mM KCl、2 U creatine phosphokinase (CPK)[Sigma, USA])。

(5) 於 30℃作用 30 分鐘，再以 100℃水浴加熱 30 秒終止反應。

(6) 以 4℃、7,840 x g 離心 10 分鐘。

(7) 吸取 400 μL 上清液至新的 1.5 mL 微量離心管，加入 700 μL 反應液 3 (50 mM Hepes-NaOH, pH7.4、20 mM MgCl2、10 mM glucose、2 U G6PDH[Roche, Germany]、2 mM NADP)，混合均勻後，吸取 1 mL 到測光管中。

(8) 於 340 nm 波長下讀取吸光度為 E1。

(9) 加入 5 μL HK (2 U) [Sigma, USA]，反應 5 分鐘後，於 340 nm 波長下讀取 吸光度為E2。

(10) 將 E2-E1 之數值帶入 ADP 標準曲線，推算出酵素活性，所得數值再除上 最初澱粉重。

5.2.4. Soluble starch synthase (SSS) 活性分析

參考Nishi 等人 (2001) 之方法，測定葉鞘中 SSS 酵素活性。

(1) 取 200 μL 酵素萃取液 (至少含粗蛋白 100 μg)，加入 200 μL 反應液 1 (50 mM Hepes-NaOH, pH7.4、1.6 mM ADPG、0.23% (w/v) glycogen、16.7 mM DTT)，於 30℃作用 30 分鐘。

(2) 於 100℃水浴作用 30 秒以終止酵素反應。

(3) 同時配製總體積為 400 μL 之 ADP 標準品 (分別含有 0、0.04、0.08、0.12、

0.16 μmole ADP)。

(4) 樣品和標準品均加入 100 μL 反應液 2 (50 mM Hepes-NaOH, pH7.4、10 mM

PCr、200 mM KCl、2 U CPK[Sigma, USA])。

(5) 於 30℃作用 30 分鐘，再以 100℃水浴加熱 30 秒以終止反應。

(6) 以 4℃、7,840 x g 離心 10 分鐘。

(7) 取 400 μL 上清液至新的微量離心管中，加入 700 μL 反應液 3 (50 mM

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Hepes-NaOH, pH7.4、20 mM MgCl2、10 mM glucose、2 U G6PDH[Roche, Germany]、2 mM NADP)。

(8) 混合均勻後，吸取 1 mL 到測光管中，於 340 nm 波長下讀取吸光度為 E1。

(9) 再加入 2 U HK[Sigma, USA]，混合均勻並反應 5 分鐘後，於 340 nm 波長 下讀取吸光度為E2。

(10) 將 E2-E1 之數值帶入 ADP 標準曲線，推算出酵素活性。

5.2.5. Starch branching-enzyme (SBE) 酵素活性分析

參考Guan 及 Preiss (1993) 之方法，測定葉鞘中 SBE 酵素活性

(1) 取 200 μL 酵素萃取液兩份 (至少含粗蛋白 100 μg)，一份經過 100℃加熱 5 分鐘變性，作為空白對照組。

(2) 加入 650 μL100 mM Hepes-NaOH (pH7.4) 及 150 μLpotato starch (濃度為 1 mg/ mL)。

(3) 混合均勻並於 30℃作用 30 分鐘後，以 100℃水浴加熱 30 秒以終止反應。

(4) 加入 50 μL 碘液 (0.1% I2、1% KI) 並混合均勻，使樣品顏色變為淡紫色。

(5) 偵測 600 nm 波長下之吸光值，將樣品吸光值扣掉空白對照組後計算活性 (每分鐘增加一個 OD 值為一個活性單位)。

5.2.6. α-amylase 酵素活性分析

參考Megazyme公司的操作手冊 (ALPHA-AMYLASE ASSAY PROCE- DURE-CERALPHA METHOD)，進行α-amylase酵素活性測定 : 以一個阻礙非 還原端被外切酵素 (例如: β-amylase、amyloglucosidase與α-glucosidase) 作用的 反應物 (non-reducing-end blocked p-nitrophenyl maltoheptaoside ; BPNPG7) 來 進行反應，其被α-amylase酵素作用後生成Blocked maltosaccharide與

p-nitrophenyl maltosaccharide，而p-nitrophenyl maltosaccharide再經由

α-glucosidase作用後可生成自由態p-nitrophenyl，偵測p-nitrophenyl在OD410的吸 光度再依照公式換算α-amylase酵素活性。

29

5.2.7. β-amylase 酵素活性分析

參 考Megazyme 公 司 的 操 作 手 冊 (BETA-AMYLASE ASSAY PROCE- DURE-BETAMYL METHOD) ， 進 行 β-amylase 酵 素 活 性 測 定 ： 以 p-nitrophenyl-α-D-maltopentaoside (PNPG5) 當做反應物，其可以被β-amylase快 速水解成maltose及p-nitrophenyl-α-D-maltotrioside，而α-amylase對PNPG5的作 用速度非常慢，p-nitrophenyl-α-D-maltotrioside再經由α-glucosidase作用後可生 成自由態p-nitrophenyl，使用高pH值之Trizma base solution停止反應後，偵測 p-nitrophenyl在OD400的吸光度再依照公式換算β-amylase酵素活性。

6. ABA 萃取與含量分析

參考Hurng 等人 (1994) 之方法，測定葉鞘中 ABA 含量

(1) 收取水稻葉鞘 15-20 mg 秤量鮮重後，用研缽及杵在液態氮下研磨至粉狀。

(2) 待樣品回溶後，加入 1.5 mL 80% (v/v) methanol (含 2% glacial acetic acid)，

混合均勻後於4℃黑暗下作用 1 小時以上。

(3) 以室溫、2,000 x g 離心 10 分鐘。

(4) 取 1 mL 上清液至 1.5 mL 微量離心管中，真空乾燥後放置 4℃黑暗中備用。

(5) 於真空乾燥過程中，同時製作 PVP column

(a) 以刀片將塑膠滴管的前後端削去適當長度，讓前端可吻合抽氣系統開 口，後端只需要切出開口即可。

(b) 將適量 PVP 粉末溶於 dH2O 中並攪拌數次，撈除浮於水面之顆粒物。

(c) 以打洞機製做圓形 3M Filter Paper，並在塑膠滴管中裝入兩層 Filter Paper 後，將塑膠滴管架設在抽氣系統上。

(d) 一邊緩慢抽氣，一邊由上端開口加入 PVP 液體，製做高度約為 2.5-3 mL 即可，待PVP 溶液中的 dH2O 流出後，即完成 PVP column。

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(6) 乾燥後的樣品加入 0.5 mL 100% methanol，再加入 0.5 mL 0.2 M NH4H2PO4

(pH6.8)，震盪使其完全溶解後，靜置於 4℃黑暗 10 分鐘。

(7) 將溶解後的樣品通過 PVP column，並收集濾液。

(8) 待濾液完全抽乾後，以 6 mL dH2O 沖洗 PVP column，並收集濾液。

(9) 在濾液中加入 100 μL glacial acetic acid，共得實際濾液約 7 mL。

(10) 先用 5 mL 100% methanol 過濾 C18 column，再用 4 mL dH2O 過濾 C18

column。

(11) 將步驟 9 的濾液通過 C18 column 並完全將濾液抽乾後，丟棄濾液。

(12) 加入 4 mL 清洗液 (20% ethanol 及 2% glacial acetic acid)，注意流量不超 過每分鐘1.5 mL，並將濾液完全抽乾後，丟棄濾液。

(13) 以 4 mL 萃取液 (55% ethanol 及 2% glacial acetic acid) 將樣品洗出，注意 流量不超過每分鐘1.5 mL，並將濾液完全抽乾，收集濾液。

(14) 將濾液真空乾燥後存放在 4℃或-20℃、黑暗下。

(15) 參考Agdia公司操作手冊 (Phytodetek® ABA Test Kit)，利用抗體免疫法進 行ABA含量測定。

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7. 啟動子釣取及序列分析 7.1. 啟動子釣取

以plant DNAZOL® Reagent (Invitrogen, USA)：植物組織為 0.3 mL：0.1 g 之 比例萃取水稻基因組DNA 後，進行聚合酶連鎖反應。

針對目標基因啟動子序列設計專一性引子 (表六)，並於適當的黏合溫度下 以具有 3’→5’ exonuclease 活性的

Phusion DNA Polymerase [FINNZYMES,

OsSUT1 基因位在 chromosome 3 上，利用 PSUT1-F1、R5; F4、R6; F5、R4 三組引子分別擴增長度為903、1076、191 bp 三個啟動子片段 (表六)，再利用 二次PCR 擴增出 1959 bp 之全長啟動子，以轉譯起始點 ATG 的 A 為+1，所擴 增出的啟動子位置位在ATG 上游-10~-1968 之區域 (圖十五)。OsSUT2 基因位 在chromosome 12，利用 PSUT2-F1、R2 引子擴增長度為 830 bp 啟動子片段 (表 六) (圖十六)，擴增範圍在-1~-830 的區域。OsSUT4 基因位在 chromosome 2，

利用PSUT4-F1、R4 引子擴增長度為 833 bp 啟動子片段 (表六) (圖十七)，其 位置位在 ATG 上游-11~-843 的區域。擴增之 OsSUT2 及 4 基因啟動子接到 pGEM-T easy vector 後，送基隆米克斯公司定序，而 OsSUT1 因為使用 blund end 之Taq DNA polymerase 所合成，故直接以 PCR 產物送定序。

7.2. 啟動子序列分析

利用NCBI網站 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 搜尋水稻葉鞘中調控醣類代

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謝及運輸關鍵基因之啟動子序列，由轉譯起始碼 (start codon) 往上游 1500 核 苷酸片斷定義為啟動子區域，利用Plant Cis-Acting Regulatory DNA Elements (PLACE) (Higo et al., 1999) 網站 (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/) 找尋啟 動子上cis-acting elements。

8. 以暫時性表現系統進行啟動子活性分析 8.1. 建構暫時性表現載體

以接有OsSUT2

、

PSUT1-R4-SmaI、PSUT2-F1- SacI/ PSUT2-R2-SmaI 與 PSUT4-F1-SacI/

PSUT4-R4-SmaI (表六)，進行 PCR 反應，分別合成長度為 1959 bp、830 bp 與 833 bp 之啟動子，再將這些啟動子利用 SacI 與 SmaI 切位接在不含 intron 之 β-glucuronidase (GUS)基因之前 (圖十九)，分別命名為

PSUT1-DF(-1968/-10)::GUS、PSUT2-DF(-830/-1)::GUS 與

PSUT4-DF(-843/-11)::GUS。另外，將三個啟動子接在含有 intron 之 GUS 基因 之前 (附錄六)，命名為 PSUT1-DF(-1968/-10)::Ubint::GUS、

PSUT2-DF(-830/-1)::Ubint::GUS 與 PSUT4-DF(-843/-11)::Ubint::GUS (圖二 十)，接好之質體 DNA 再以 SacI 與 SmaI 兩限制酵素作用後進行電泳分析，確 定片段無誤後定序以確定載體構築成功。

8.2. 建構 OsSUT4 基因不同長度啟動子暫時性表現載體

設 計 PSUT4 上 專 一 性 引 子 : PSUT4-DF2-SacI 、 PSUT4-DF2a-SacI 、 PSUT4-DF3-SacI、PSUT4-DF3a-SacI、PSUT4-DF4-SacI、PSUT4-DF5-SacI、

PSUT4-DF6-SacI 、 PSUT4-DF7-SacI 與 PSUT4-R4-smaI ( 表 七 ) ， 以 PSUT4-DF(-843/-11)::Ubint::GUS 質體 DNA 當作模板，進行 PCR 反應 (PCR

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條件與上述合成OsSUTs 基因啟動子之條件相同)，分別合成出 633、592、540、

473、424、318、238 及 129 bp 之 5’端 deletion 啟動子片段，合成出片段以 SacI 及SmaI 限制酵素作用後，接於含有 intron 之 GUS 基因之前 (圖二十二) 並送 定序確認無誤。

8.3. 抽取使用於基因槍射擊的質體 DNA

參考QIAGEN Plasmid Purification Handbook，抽取高純度質體 DNA 進行 基因槍暫時性表現分析。

8.4. 微攜帶子 (microcarrier) 的準備與 DNA 包覆

根據Sanford等人 (1993) 的方法，準備基因槍射擊用的微攜帶子(鎢粒子) (1) 秤取60 mg鎢粒子 (Bio-Rad, USA) 於1.5 mL的微量離心管中，加入1 mL

100% ethanol後，強力振盪10分鐘。

(2) 以桌上型微量離心機離心5秒，使鎢粒子沉澱。

(3) 移除上清液，加入1 mL無菌水清洗，強力振盪1分鐘後室溫靜置1分鐘。

(4) 再以微量離心機離心5秒，使鎢粒子沉澱。

(5) 移除上清液後重複步驟3-4二次。

(6) 加入1 mL滅過菌之50% glycerol，使最終濃度達60 mg/mL，每50 μL分裝於 1.5 mL微量離心管中，使每管微攜帶子含量為3 mg，保存於-20℃備用。

(7) 將6 μg啟動子暫時性表現質體DNA與6 μg pAHC18質體DNA (附錄三) 在 1.5 mL離心管中混合均勻。

(8) 將製備好之鎢粒子強力振盪，使鎢粒子均勻散布在溶液中。

(9) 一邊以Scientific Industries vortex-genie 2 機型之level 6強度進行振盪，一邊 緩速且依序加入步驟1混合均勻的質體DNA、50 μL 1M CaCl2及20 μL 0.1M spermidine (需新鮮配製) 後，持續振盪1分鐘。

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(10) 於室溫靜置5分鐘。

(11) 以微量離心機離心2秒使鎢粒子沉澱後，以pipetman小心移除上清液。

(12) 加入100 μL 70% ethanol後並立即以pipetman小心移除上清液。

(13) 加入140 μL 100% ethanol，以低速振盪2-3秒使鎢粒子懸浮，即製備完成。

8.5. 基因槍射擊

(1) 將巨攜帶子 (macrocarriers)、巨攜帶子支撐物 (macrocarrier holder)、破裂 圓盤 (rupture disk)、破裂圓盤保持蓋 (rupture disk retaining cap)、微攜帶子 送出組 (microcarrier launch assembly) 及停止屏 (Stoping screen) 以 70%

ethanol 滅菌後，放置無菌操作台吹乾，將 macrocarriers 裝載在 macrocarrier holder 上。

(2) 將帶有DNA的鎢粒子平均塗抹於macrocarriers/macrocarrier holder上。

(3) 打開氦氣筒氣閥，確定氦氣筒壓力保持大於粒子撞擊衝破圓盤所需壓力 200 psi左右。

(4) 打開PDS-1000/HE基因槍 (Bio-Rad, CA) 電源開關，以70% ethanol消毒基 因槍內壁。

(5) 將消毒過之rupture disk置入rupture disk retaining cap中，放置於氣體加速管 末端，以專用板手 (torque wrench)鎖緊。

(6) 將macrocarriers與stoping screen置入microcarrier launch assembly中。

(7) 將microcarrier launch assembly與目標細胞置入射擊腔適當位置，把門關上 後將射擊腔抽真空，當真空度達26-27 inch-Hg時，快速壓住Hold鈕使壓力 固定。

(8) 一直壓住Fire 鈕直到破裂圓盤破掉且壓力值達零才放開。

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8.6. 萃取水稻葉鞘蛋白質

參考 Shen (1996) 等人之方法，萃取水稻葉鞘蛋白質以及進行 GUS 及 Luciferase 活性分析

(1) 使用 KURABO SH-100 均質機及 5 mm 鋼珠，以 1,400 rpm、30 秒兩次之 條件將葉鞘撞擊成粉狀。

(2) 加入 1 mL 萃取液 (100 mM NaPO4, pH7、5 mM DTT、3 mg leupeptin、50%

(v/v) glycerol) 混合均勻。

(3) 以 4℃、13,250 x g 離心 10 分鐘。

(4) 將上清液吸到新的離心管中，分別吸取 100 μL 進行 Luciferase 及 GUS 酵 素活性測定，其他保存在-20℃中。

8.7. Luciferase 活性測定

(1) 先配製 2X Luciferase Assay Buffer (LAB) 儲存液 ( 60 mM Tris-SO4 ,

pH7.7、20 mM MgCl2、20 mM DTT、2 mM EDTA)，放置-20℃備用。

(2) 準備 1 X LAB + 0.5 mM Luciferin (100 μL/sample，每次至少配製 3 mL)，置 冰上且避光。

(3) 再配製 2 X LAB+2 mM ATP (100 μL/sample)，配製完放置冰上備用。

(4) 將 1 X LAB+0.5 mM Luciferin 注入到 Lumat LB 9507 冷光儀之 inject1 管子 中，吸取100 μL 2 X LAB+2 mM ATP 至測量玻璃試管底部，再加入 100 μL 樣品液，混合均勻後測定冷光強度。

8.8. GUS 活性測定

(1) 吸取 100 μL 萃取液到微量離心管中，加入 200 μL GUS Assay Buffer (2.5 mM 4-methylumbelliferyl β-D-glucuronide (MUG)、50 mM NaPO4 , pH7、10 mM EDTA、10 mM DTT、20 μg/mL leupeptin、20% (v/v) methanol、0.02%

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sodium azide)，混合均勻。

(2) 於 37 ℃培養 20 小時。

(3) 加入 800 μL Carbonate Stop Buffer (0.2M Na2CO3, pH11.2) 終止反應。

(4) 分別取 200 μL 標準品及樣品液至微量測試盤 (Labsystem CLINIPLATE) 小槽 (well) 中，使用 Labsystems Fluoroskan Ascent FL (Type374) 螢光測量 儀測定螢光強度 (Filter : Excitation 355 nm，Emission 460)，將機器所得數 值直接除以Luciferase 數值，得到 GUS 相對表現量。

9. Electrophoresis Mobility Shift Assay (EMSA)

參考Panomics操作手冊 (EMSA ”Gel Shift” Kit )，進行細胞核蛋白與PSUT4 啟動子片段的結合分析

9.1. 製備 DNA 探針

分 別 利 用 PSUT4-DF3-Biotin 、 PSUT4-DR3 與 PSUT4-DF2-Biotin 、 PSUT4-DR2 兩對引子 (表七)，以 PSUT4-DF(-843/-11)::Ubint::GUS 質體 DNA 當作模板，進行 PCR 反應合成具有 Biotin 標定的 DNA 探針，分別命名為 DF(-550/-484) (67 bp)與 DF(-643/-603) (41 bp) (圖二十四)。利用 PSUT4-DF3、

PSUT4-DR3 與 PSUT4-DF2、PSUT4-DR2 兩對引子合成沒有 Biotin 標定的 DNA 片段，分別當做DF(-550/-484)與 DF(-643/-603)的競爭者。

9.2. 利用 polyacrylamide gel 純化 DNA 探針

(1) 製 做 1.5 mm 厚 度 5% Non-denaturing polyacrylamide gel (2 mL 5X tris-borate/ethylenediamine tetra-acetic acid (TBE)、2.5 mL 40% Acryla- mide/Bis、0.625 mL 80% glycerol、0.02 mL tetramethylethylenediamine (TEMED)、14.58 mL dH2O、0.3 mL 10% ammonium persulfate)。

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(2) 待膠體凝固後，置於 0.5 X TBE Transfer Buffer 中。

(3) 將 DNA probe 加入 1/10 體積的 10X DNA loading dye，混合均勻後 loading 到well 中。

(4) 以 100 V 進行電泳 45 分鐘。

(5) 電泳完畢後將膠體移到含有 0.5 μg/ mL EtBr 之 0.5X TBE 中，於室溫下搖 晃20~30 分鐘。

(6) 在長波長 ( 312 nm) 的 UⅤ燈下對照 DNA marker，將含有 DNA 探針的膠 體切下，放置於微量離心管中。

(7) 以可拋棄的微量吸管頭搓碎微量離心管中的膠體。

(8) 加入 2X 體積的 Acrylamide Gel Elution Buffer (0.5 M ammonium acetate、10 mM magnesium acetate、1 mM EDTA，pH 8.0、0.1% SDS)混合均勻後，於 37℃震盪培養隔夜。

(9) 以 4℃、13,230 x g 離心 1 分鐘，將上清夜移到新的微量離心管中。

(10) 再加入 0.5X 體積的 Acrylamide Gel Elution Buffer 到原先的離心管中，短 暫震盪令Buffer 與膠體充分混合。

(11) 以 4℃、13,230 x g 離心 1 分鐘，將上清夜與步驟 9 的上清液收集在同一 離心管中。

(12) 將上清液通過 0.45 μm 之過濾膜，以去除殘留膠體。

(13) 收集濾液，於 4℃中加入 2X 體積的 100% ethanol 後放置冰上 30 分鐘。

(14) 以 4℃、13,230 x g 離心 10 分鐘，移除上清夜。

(15) 先以 200 μL TE buffer (pH8.0) 溶解 DNA，再加入 25 μl 3M sodium acetate (pH5.2)。

(16) 以 2X 體積 100% ethanol 再沉澱 DNA 一次。

(17) 以 70% ethanol 潤洗沉澱物，離心乾燥後以 50 μL Tris-EDTA (TE) buffer (pH8.0) 回溶 DNA。

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(18) 取 2 μL 進行定量，並將 DNA 濃度調整為 10 ng/ μL 後儲存於-20℃備用。

9.3. 葉鞘核蛋白萃取

參考Panomics操作手冊 (Nuclear Extraction Kit)，進行水稻葉鞘核蛋白萃取 (1) 將 0.5 g 葉鞘組織，以均質機打擊 6 秒 (轉速 13,000 rpm) 後放置冰上。在

冰上加入1 mL Buffer A working Reagent (0.96 mL 1X buffer A、10 μL 100 mM DTT、10 μL protease inhibitor、10 μL phosphatase inhibitor I、10 μL phosphatase inhibitor II)。

(2) 再以均質機打擊 6 秒 (轉速 13000 rpm) 後，放置冰上 15 分鐘。

(3) 以 4℃、850 x g 離心 10 分鐘，丟棄上清液。

(4) 在冰上加入 1 mL 新鮮 Buffer A working Reagent，以均質機敲打 6 秒後，放 置冰上15 分鐘。以 4℃、1,400 x g 離心 3 分鐘，移除上清液並將沉澱物放 置冰上。

(5) 加入 150 μL 的 Buffer B working Reagent (145.5 μL 1X buffer B、1.5 μL protease inhibitor、1.5 μL phosphatase inhibitor I、1.5 μL phosphatase inhibitor II)，並用最快的轉速震動 10 秒。

(6) 將離心管放置冰上 60 分鐘，每 20 分鐘溫和搖晃一次。

(7) 以 4℃、1,400 x g 離心 5 分鐘後，將上清液移到乾淨的離心管中。

(8) 取 2 μL 進行蛋白質定量，其於儲存在-80℃備用。

9.4. 形成 DNA –Transcription factor (DNA-TF)複合物

(1) 標準流程:在 0.2 mL 微量離心管中依序加入 1 μL Nuclear Extract (5~10 μg/μL)、1 μL poly d(I-C) (1 μg/μL)、2 μL 5X binding Buffer、5 μL nuc- lease-free water，混合均勻後在室溫放置 5 分鐘。加入 1 μL labeled TF probe (10 ng/μL)，混合均勻後於 15℃培養 30 分鐘。

(2) 競爭型流程:在 0.2 mL 微量離心管中依序加入 1 μL Nuclear Extract (5~10

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