第三章 研究方法與材料
第二節 內視鏡大隱靜脈摘取手術對內皮細胞的影響
雖然使用內乳動脈來進行冠狀動脈繞道手術，有較好的長期暢通率，一項統 計顯示，大隱靜脈仍然是最常被使用來進行冠狀動脈繞道手術的材料（Seabolt PB，2003；Bitondo JM，2002）。大隱靜脈摘取的過程內皮細胞是否受損，對長 期的暢通率扮演相當重要的角色（Patel AN，2001）。內皮細胞的受損可能會導 致血管內膜增生，進而影響血管的暢通（Yun KL，2005；Rodrigus IE，2001；
Patel AN，2001）。到目前為此，許多研究顯示用內視鏡摘取的靜脈血管內皮和 傳統開放性傷口所摘取的靜脈血管內皮，在型態上和免疫組織化學染色上並沒有 差異。進行繞道手術六個月後的血管攝影追蹤發現，用內視鏡摘取的靜脈和傳統 開放性傷口所摘取的靜脈，在血管阻塞的機會並沒有差別（Yun KL，2005）。在 五年之內Major adverse cardiac event-free survival在兩邊患者之間沒有差別（Allen KB，2003）。於是乎為了釐清靜脈血管內皮受傷的情形，我們進行了一系列探討。
整體研究架構如下圖，分別針對型態與功能二部分進行研究，以組織免疫染 色、定量免疫酵素分析及即時定量連鎖聚合脢反應三種實驗方法來進行。如同前 段文章，內視鏡大隱靜脈摘取術是使用 Vasoview system。當我們進行大隱靜脈 摘取，內視鏡完成血管剝離，我們在膝蓋附近的遠心端再額外開一個2 cm 的傷 口，進行開放傷口的大隱靜脈摘取，在大隱靜脈離開身體以後，兩端分別摘取5 mm 的大隱靜脈當作標本，其中近心端的大隱靜脈視同內視鏡摘取的標本，遠心 端的大隱靜脈視同開放傷口摘取的標本。總共有29 位患者共摘取 29 對的大隱靜 脈標本進行研究。
Saphenous vein (from CABG patient)
EVH OVH
Endothelial function Endothelial integrity
ELISA Real-time PCR IHC
eNOS Cox-2 ET-1
CD31 eNOS
Cox-2 ET-1 (N=29)
Western blotting
eNOS Cox-2 ET-1
Morphology Function
Part I Part II Part III Part IV
（一） 以CD31 進行血管內皮形態的研究
CD31 是免疫球蛋白家族的一員，在血管的組織中主要表現在內皮細胞，因 此可以當作內皮細胞的一個鑑別工具。
大 隱 靜 脈 檢 體 自 患 部 取 下 後 ， 以 免 疫 組 織 化 學 染 色 法
（Immunohistochemistry，IHC）進行血管內皮形態的分析，實驗操作步驟如下圖。
大隱靜脈的標本經由福馬林固定，再加以石臘包埋然後切片，接著使用CD31 的 單株抗體進行染色。所使用的單株抗體是 Monoclonal anti-CD31（PECAM-1）
antibody（clone JC70A，Dako，Denmark）。此外，所有的標本加染 hematoxylin，
再以顯微鏡鑑別內皮細胞被染色的程度。我們設計了一個評分標準，根據CD31 陽性染色的部分佔整圈血管圓周的比例，分為：0 = none，1≦10%，2 = 10-25%，
3 = 25-50%，4 = 50-75%，5 = 75-100%用來評估血管內皮受損的比率。每個標本 分別由三個獨立而且有經驗的研究員進行評分，然後計算平均。
自病人身上取下大隱靜脈檢體
↓
以Formadehyde 固定、paraffin 封片
↓
Dewaxed（deparaffinization）30 分鐘
↓
浸泡在3% H2O2中（阻斷endogeous hydrogen peroxidase 作用）10 分鐘
↓
染一級抗體（CD31，1：30），4℃隔夜
↓
染二級抗體，20 分鐘
↓
Peroxidase-cpnjugated strepavidin 10 分鐘
↓
Chromogen DAB 呈色 5-10 分鐘
↓ Mounting
（二） 以血管內皮中endothelial nitric oxide synthase（eNOS）、endothelin-1
（ET-1）、和 cyclooxygenase-2（COX-2）進行血管內皮功能的研究 一氧化氮是 90 年代在相當受重視的一個分子，它可以保持血管的放鬆、避 免血栓的形成，可以說是維持血管內皮功能最重要的一個成分。一氧化氮的形 成，來自endothelial nitric oxide synthase（eNOS） 和 inducible nitric oxide synthase
（iNOS）。當血管內皮受損時，會因為 eNOS 的減少，而使得一氧化氮的量減少，
造成血栓形成、血管收縮、和血管的阻塞。因此評估經由不同手術方式所摘取的 大隱靜脈，它的內皮細胞 eNOS 的表現，可以當作是間接鑑別不同手術方式優 缺點的一種比較方式。為求慎重起見，除了前述以CD31 評估血管內皮細胞的形 態外，我們希望用更完整的面向來評估內皮細胞的功能，如endothelin-1（ET-1）、
和cyclooxygenase-2（COX-2）。其中 NO 和 ET-1 是血管內皮細胞主窄血管平滑 肌收縮或舒張的重要分子，也在血管粥狀動脈硬化扮演重要的角色。COX-2 則
(1) Tris (base), Mallinckrodt Baker Inc., NJ, USA
(2) Sodium dodecyl sulfate (SDS), PIERCE Biotech., IL, USA (3) Proteinase inhibitor cocktail, Sigma-Aldrich, Inc., MO, USA (4) Millipore express PES membrane, MillexGP filter unit,
Millipore, Co, Ireland
(5) Amicon Ultra-4 (30K) centrifugal filter device, Millipore Co., MA, USA
(6) BCA Protein Assay kit, Thermo Fisher Scientific Inc., IL, USA
(7) PageRuler prestained protein ladder, Fermentas International Inc., Ontario, Canada
(8) Mouse anti-actin monoclonal antibody, Chemicon International, Inc., CA, USA
(9) Phospho-eNOS (Ser1177) antibody, Cell Signaling Technology Inc., MA, USA
(10) eNOS/NOS Type III, BD Transductional Laboratories, BD Biosciences Pharmingen, CA, USA
(11) Mouse anti-human cyclooxygenase 2 (COX 2) monoclonal antibody, Chemicon International Inc., CA, USA
(12) Goat anti nouse IgG (H&L) peroxidase conjugated affinity purified antibody, Chemicon International, Inc., CA, USA (13) ECL Plus western blotting detection reagents, Amersham
Biosciences UK Limited, UK
(14) Quantikine human eNOS immunoassay, R&D Systems Inc., MN, USA
(15) QuantiGlo human Endothelin-1 immunoassay, R&D Systems Inc., MN, USA
(16) TiterZyme human cyclooxygenase-II enzyme immunometric assay kit, Assay Designs Inc., MI, USA
2. 檢體收集
在開刀房內取下病人大隱靜脈後，儘速放入生理食鹽 水並確保整段檢體均浸潤於試劑中，於無菌操作台在液面 下將檢體剪碎，放入冷凍小管並以液態氮急速冷凍，保存 於-80℃。
3. 蛋白質萃取
檢體自-80℃取出置於冰上回溫，每檢體秤重約 30 mg，配製萃取溶液，以均質機將組織打散，離心收集上 清液進行可溶性蛋白質含量測定。詳細步驟如下。
檢體秤重約30 mg
↓
每管加入1 mL 萃取溶液，置冰上作用 30 分鐘，萃取溶液配方如下：
Sample number 1
ddH2O (μL) 878.5
1.0 M Tris (pH7.4) (μL) 20
10% SDS (μL) 100 protease inhibitor (μL) 1.5
Total volume (mL) 1
↓
以組織均質機（polytron）把組織打散
↓
離心4℃、12,000rpm、15 分鐘
↓
收集上清液至15 mL 離心管
（重複離心、收集上清液共三次）
↓
再加入1 mL 萃取溶液混勻，定量至 4 mL
↓
以過濾膜過濾至Amicon Ultra 離心管
↓
離心4℃、4,000rpm、20 分鐘
↓
收集上清液至微量離心管，
進行蛋白質含量測定，最後保存於-80℃
4. 蛋白質含量測定
使用BCA assay 測定可溶性蛋白質濃度，參考操作手 冊進行實驗，步驟如下：
配製標準品BSA，並序列稀釋，
濃度分別為2000、1500、1000、500、250、125、25、0 μg/mL，
每濃度以二重複加入96 孔盤（25 μL/well）
↓
樣品以三重複加入96 孔盤（以 ddH2O 稀釋 10 倍，25 μL/well）
↓
配製呈色試劑（working reagent）A：B＝50：1，依序加入 96 孔盤（100 μL/well）
↓
蓋好96 孔盤，置於 37℃作用 30 分鐘
↓
於室溫冷卻，並小心以針頭戳破孔盤內的氣泡
↓
以多功能微盤分析儀分析波長562 nm 之吸光值
5. 西方墨點分析：
(1) 實驗步驟
將萃取出的蛋白質與SDS gel loading buffer 混合煮沸 5 分鐘
↓
以無塵紙沾75％酒精清潔玻璃表面，架設電泳組合
↓
製備膠體（separting gel 8-10％；stacking gel 5%）
↓
注入樣品後以1x Tris-Glycine-SDS running buffer 跑膠，
當追蹤染劑移動至膠底時即停止
↓
以半乾式轉漬法（semi-dry transfer）將分離後的蛋白轉漬到 PVDF 膜上，注意 不要有氣泡殘留在濾紙間隙
↓
轉漬完成的PVDF 膜以 5％脫脂牛奶在室溫下進行 blocking，1 小時
↓
以1X TBST 清洗 PVDF 膜 5 次，每次均勻搖晃 5 分鐘
↓
倒掉TBST，加入一級抗體，放進 4℃冰箱隔夜反應
↓
第二天取出，回收一級抗體，加入1X TBST 清洗 PVDF 膜 3 次，
每次均勻搖晃10 分鐘
↓
倒掉TBST，加入二級抗體，室溫下反應 1 小時
↓
倒掉二級抗體，以1X TBST 清洗 PVDF 膜 3 次，每次均勻搖晃 5 分鐘
↓
以ECL plus 試劑在暗房呈色，壓成 X 光片
↓
比對PVDF 膜以標示分子量大小，掃瞄存檔
(2) 實驗溶液配方
4X SDS gel-loading buffer (4X dye), -20℃
Reagent Volume
ddH2O 10 mL
1.0 M Tris-HCl, pH6.8 (stock) 10 mL
SDS 4.0 g
Bromophenol Blue 0.2 g
Glycerol 20 mL
Total 40 mL
Divide into 1.5 mL eppendorffs, 800μL/tube.
Add 200μL/tube 2-mercaptoethanol before use.
10% SDS-PAGE
Reagent Volume (For 1 piece of 1.5 mm)
ddH2O 4000μL
30% acrylamide mix
(acrylamide:Bis=29:1) (stock) 3300μL 1.5 M Tris-HCl, pH8.8 (stock) 2500μL 10% SDS (stock) 100μL 10% APS (stock) 100μL TEMED (added last) 40μL
Total 10 mL
5% Stacking gel
Reagent Volume (For 1 piece of 1.5 mm)
ddH2O 1400μL
30% acrylamide mix
(acrylamide:Bis=29:1) (stock)
330μL
30% Acrylamide/Bis mix , 4℃, dark
Reagent Volume Acrylamide/Bis 29:1 solution (40%) 75 mL
ddH2O 25 mL
Total 100 mL
1.5 M Tris-HCl, pH8.8, 4℃
Reagent Volume Tris (base) 36.34 g
ddH2O 200 mL
Total 200 mL
Adjust pH value to 8.8 by 6N HCl.
1.0 M Tris-HCl, pH6.8, 4℃
Reagent Volume Tris (base) 12.113 g
ddH2O 100 mL
Total 100 mL
Adjust pH value to 6.8 by 6N HCl.
10% SDS, RT
Reagent Volume
SDS 10 g
ddH2O 100 mL
Total 100 mL
Divide into 15 mL centrifuge tubes, 10 mL/tube. Vortex before use.
10% APS, -20℃
Reagent Volume Amonnium persulfate (APS) 1 g
ddH2O 10 mL
Total 10 mL
Divide into 1.5 mL eppendorffs, 1.0 mL/tube.
1x Tris-Glycine-SDS running buffer, RT
Reagent Volume (for 1 electrophoresis tank)
10x running buffer (stock) 100 mL
ddH2O 900 mL
Total 1 L
10X Tris-Glycine-SDS running buffer, 4℃
Reagent Volume Final conc.
Tris (Base) 30 g 0.25 M Glycine 144 g 2 M SDS 10 g 0.1 M
Total 1000 mL
Anode buffer I, pH10.4, 4℃
Reagent Volume Final conc.
Tris (base) 18.171 g 300 mM
Methanol 50 mL 10%
Total (add ddH2O) 500 mL
Adjust pH value to 10.4 by 5N NaOH or 6N HCl.
Anode buffer II, pH10.4, 4℃
Reagent Volume Final conc.
Tris (base) 1.514 g 25 mM
Methanol 50 mL 10%
Total (add ddH2O) 500 mL
Adjust pH value to 10.4 by 5N NaOH or 6N HCl.
Cathode buffer, pH9.4, 4℃
Reagent Volume Final conc.
Tris (base) 1.514 g 25 mM
Glycine 1.501 g 400 mM
Methanol 50 mL 10%
Total (add ddH2O) 500 mL
Adjust pH value to 9.4 by 5N NaOH or 6N HCl.
5% blocking buffer (fresh-prepared, for 1 piece)
Reagent Volume Non-fat milk 2.5 g
1x PBS (sterile, stock) 50 mL
Total 50 mL
1x TBST, RT
Reagent Volume 10x TBS (stock) 400 mL
Tween-20 2 mL
Total (add ddH2O) 4 L
10x TBS, pH7.6, 4℃
Reagent Volume Final conc.
Tris (base) 24.228 g 0.2 M NaCl 87.66 g 1.5 M Total (add
ddH2O)
1000 mL
Adjust pH value to 7.6 by 6N HCl.
6. 定量酵素免疫分析：
(1) eNOS：實驗方法參考原廠操作手冊進行，步驟如下。
配製溶液
eNOS standard
Standard Stock A B C D E F G
Wash buffer
25X Concentrate 1 mL
加入eNOS conjugate，200 μL/well
↓
蓋好96 孔盤，室溫搖晃 2 小時
↓
以wash buffer 清洗二次，每次 150 μL/well，以微量吸管將殘液吸乾
↓
配substrate solution
↓
以wash buffer 清洗一次，每次 150 μL/well，以微量吸管將殘液吸乾
↓
加入substrate，200 μL/well，室溫靜置避光作用 30 分鐘
↓
加入stop solution，50 μL/well，
30 分鐘內以多功能微盤分析儀分析波長 450 nm 之吸光值（背景波長 570 nm）
(2) ET-1：實驗方法參考原廠操作手冊進行，步驟如下。
配製溶液
ET-1 standard
Standard Stock A B C D E F G
加入RD1-19，100 μL/well
↓
加入ET-1 conjugate，200 μL/well
↓
蓋好96 孔盤，室溫搖晃 3 小時
↓
以wash buffer 清洗四次，每次 400 μL/well，將殘液吸乾
↓
配substrate solution
↓
以wash buffer 清洗四次，每次 400 μL/well，將殘液吸乾
↓
加入working Glo reagent，100 μL/well，室溫靜置避光作用 5-20 分鐘
↓
以多源性偵測儀以冷光分析，模式設定如下：
1.0 min. lag time；0.5 sec/well read time；summation mode；auto gain on
(3) COX-2：實驗方法參考原廠操作手冊進行，步驟如下。
配製溶液
COX-2 standard
Standard A B C D E F G H
Wash buffer
25X Concentrate 1 mL
加入eNOS conjugate，200 μL/well
↓
蓋好96 孔盤，室溫搖晃 2 小時
↓
以wash buffer 清洗二次，每次 150 μL/well，以微量吸管將殘液吸乾
↓
配substrate solution
↓
以wash buffer 清洗一次，每次 150 μL/well，以微量吸管將殘液吸乾
↓
加入substrate，200 μL/well，室溫靜置避光作用 30 分鐘
↓
加入stop solution，50 μL/well，
30 分鐘內以多功能微盤分析儀分析波長 450 nm 之吸光值（背景波長 570 nm）
II. RNA 分析
延續的第二部分的蛋白質研究，我們發現經由不同的手術方式作摘取的大隱 靜脈，其中 eNOS 蛋白質的含量並沒有差別，我們可以理解從一個刺激，訊號 的傳遞，基因的表現，包括 DNA 的轉錄和 RNA 的轉譯，到形成一個具有功能 的蛋白質，是需要相當時間的。因此我們回過頭，希望看看上游 RNA 的差別。
1. 實驗試劑
(1) RNA 穩定試劑（RNAlater RNA stabilization reagent, Qiagen Inc., Germany）
(2) 總量 RNA 純化試劑組（RNeasy Mini kit, Qiagen Inc., Hombrechtikon, Switzerland）
(3) 核酸酵素（DNase-free RNase set, Qiagen Inc., Hombrechtikon, Switzerland）
(4) 蛋白質水解酵素（Proteinase K, Qiagen Inc., Hombrechtikon, Switzerland）
(5) 核酸轉錄試劑組（IMProm-II Reverse Transcription System, Promega, WI, USA）
(6) 核酸染色劑（LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I, Roche Diagnosis Inc., Mannheim, Germany）
2. 實驗方法 (1) 檢體收集
在開刀房內取下病人大隱靜脈後，儘速放入RNA 穩定 試劑並確保整段檢體均浸潤於試劑中，於無菌操作台在液 面下將檢體剪碎，放入微量離心管置於4℃冷藏，第二天 取出離心10,000 rpm、4℃、3 分鐘，去除 RNA 穩定試劑 後將檢體保存於-80℃。
(2) RNA 萃取與測定
將檢體由-80℃冰箱取出置於冰上，每檢體秤重約 30 mg 後參考總量RNA 純化試劑組之操作步驟進行萃取，操作 步驟如下。
檢體秤重約30 mg
（以下全程室溫）
↓
加入300 μL RLT 萃取溶液
↓
以組織均質器（Tissue Ruptor）反覆將檢體打碎，
再以小型桌上型離心機稍作離心
↓
離心14,000 rpm、1 分鐘、22℃（重複 2 次）
離心14,000 rpm、1 分鐘、22℃（重複 2 次）