第二章 基本原理與文獻回顧
2.2 表面電漿子共振金膜之固定化
2.2.2 分子固定化技術
隨著SPR技術的進步，也促使了許多針對不同物質的固定化方式的發
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展，這些物質除了蛋白質，也包含DNA、RNA、醣類結構，以及各種有機 分子，像是脂類或其他更複雜的自然產物。固定化的方法，從早期的吸附，
到現在利用化學共價鍵和不同種類的專一性，已成功且廣泛的發展。如圖 2.6所示，本論文將簡單介紹最普遍的分子固定化技術，包括共價鍵結以及 非共價鍵結的捕捉技術。
圖2.6、不同的固定化方法及欲測薄膜表面分子鍵結示意圖
共價鍵結法 (covalent Immobilization)
由於簡單的分子吸附過程並不穩定，為了控制分子固定化的過程，有 許多表面修飾技術的方法已被提出。透過不同種類的官能基被固定到基板 表面後，使得官能基與官能基之間可以穩定地互相鍵結，此方法即為共價 鍵結。此技術更可透過表面活化步驟來提升基板與生物分子間的鍵結力。
常見的有直接共價鍵結法與間接共價鍵結法。
直接 共 價鍵 結 法為 利用 表 面修 飾 後的 羧基 (carboxylic acid groups, -COOH)與生物分子的胺基(amino groups, -NH2)直接鍵結來檢測生物分子。
雖然將胺基與活化的羧基群耦合是組成共價鍵結最常見的方法，但在某些 特定情況下，如分子可能缺乏胺基群等情況，我們需要其他更合適的替代
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方法[20]。常見的間接共價鍵結法如醛基耦合法等。而本論文係使用直接 共價鍵結法來執行實驗，並透過傳統金膜與石墨烯氧化物修飾後之薄膜比 較靈敏度的差異。使用此種方法可有效地節省實驗成本與時間，因此將會 著重於羧基與胺基的直接共價鍵結來介紹。
將黃金薄膜表面耦合成羧基，是共價鍵結中最廣泛使用的方法。而最 常使用的親核試劑是賴氨酸殘基(lysine residues)中的氨基群，而羥基 (hydroxyl groups)也被廣泛地使用。
圖 2.7、透過 EDC/NHS 活化羧基群之流程示意圖
如圖2.7，我們常以碳二亞胺(carbodiimide)試劑將表面活化來促使羧基 與胺基之間的醯胺鍵(amide bond)的組成，或是羧基與羥基之間的酯鍵 (ester bond)的組成。最普遍使用的活化劑為可溶於水的1-乙基-(3-二甲基氨 基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC) [21]。使用碳二亞胺的目的在於其可產生具 活性的O-acylisourea group，作為中間介質與羧酸基作用，接著與合適的親 核試劑反應。然而在水溶液中，這個中間介質O-acylisourea的活性非常高，
若是沒有被其他競爭的親核試劑捕捉的話，會快速水解又轉變回羧酸。這 個副作用可以輕易地被碳二亞胺與活性羥基化物的混合物所克服，所形成 的活性酯衍生物可以穩定幾分鐘至幾小時。
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而N-羥基丁二醯亞胺(NHS)非常適合應用在活化過程中，NHS通常在 高濃度下與EDC溶解於水中。EDC與NHS扮演一個緩衝試劑的角色，其酸 鹼值約在pH 6左右，在這個條件下，NHS能達到酯化反應的最佳速率。雖 然還有其他像是硝基苯酚(nitrophenol)的化合物也能夠進行酯化反應，但由 於NHS在水中的溶解度佳、相對毒性低、且能夠在兩個步驟內完成耦合，
所以是最常被使用的活化劑。
非共價捕捉法 (non-covalent capture)
前面所敘述的共價鍵結方式，在某些情況下會有所限制。例如，分子 在低於所需的耦合條件下會不穩定，或是鍵結的活性會降低；如果分子是 出現在細胞裂解液或其他複雜的物質中的小量樣品，其他問題也可能浮現。
在這種情況下，選擇非共價捕捉(non-covalent capture)的固定化方法較佳。
非共價捕捉法的原理，是基於感測器表面的試劑與待測物之間的親和性鍵 結，或是在待測物加上能夠被辨別、捕捉的標記。此方法的優點為在分析 之後可以除去固定化結合的配對，經由表面再生的步驟，在下一個測試的 循環重複使用；與共價耦合的方法相比，缺點為樣品的大量消耗。
最常使用的試劑是具特異性的抗體，對應於特殊的蛋白質，或是標記 的蛋白質，也就是所謂的免疫反應。常用的標記包含GST，FLAG及poly-His residues。除了抗體外，也有可能是由其他分子組成。像是His標記的蛋白 質就可以被氨三乙酸(nitrilotriacetic acid, NTA)和鎳離子金屬螯化物所捕捉。
這樣的鍵結可以輕易地藉由像是氫氧化鈉(NaOH)或者鹽酸(HCl)等酸鹼試 劑所破壞，感測器表面經過活化之後又可重複使用。
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