第二章 基本原理與文獻回顧
2.4 肺結核的診斷與恆溫環狀擴增法
2.4.1 肺結核的診斷
肺結核為一種由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)所引 起的感染性疾病，結核分枝桿菌是一種傳染性極強的細菌。結核分枝桿菌 會經由肺結核病患以咳嗽或打噴嚏的方式飛沫傳染，肺結核不僅會感染肺 部，也同樣會影響肺以外的器官，若發病會造成組織與器官損壞。一般而 言，被結核分枝桿菌感染後大約有 10%的人會發病，成為肺結核的患者，
而肺 結核 的 發生 率 比感 染 人 類 免疫 缺 乏病 毒(human immunodeficiency virus, HIV)還要高。其中，男人感染的比率較為女人常見，並且大部分發 生於壯年期族群，大約有三分之二的病患年齡介於 15-59 歲。根據最新的 統計數據指出，2010 年估計包含新的與經常性之肺結核案例共有八百八十 萬件，其中有五百七十萬被診斷出來，而在通報的病例中，有二十九萬的 multidrug-resistant TB (MDR-TB)病例僅有五萬三千人(約 18%)被診斷出來。
每年，肺結核大約造成兩百萬人的死亡，且主要發生於發展中國家，而目 前在全球的案例中，肺結核的發生率每年約攀升 2%左右。結核分枝桿菌 (mycobacterium tuberculosis complex, MTBC)病毒的感染往往比較難以診 斷，因為患者通常不具有明顯的發病症狀，因此在臨床上對於結核桿菌病 毒的快速檢驗非常的重要[45-46]。
2.4.2 恆溫環狀擴增法
2000 年時，Notomi 等人[47]提出了一種新型的核酸擴增法，並將其取
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名為恆溫環狀擴增法(Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP)。其 特點為實驗操作簡單，在恆溫環境之下即可進行。擴增過程主要為選定四 個引子(Primers)去辨識目標 DNA 的 6 段特定序列，因此產物之專一性較高。
傳統的聚合酶連鎖反應(Polymerase chain reaction, PCR)方法需要昂貴的儀 器進行熱循環反應，然而 LAMP 技術只需要簡單的恆溫儀器，如水浴槽，
並將溫度固定於 60℃左右即可進行實驗。比起傳統 PCR 作用之 107倍的產 物量且需要 2 至 3 小時的作用時間，透過 LAMP 技術放大的產物量可高達 1010倍，而且作用時間僅需 15 至 60 分鐘，為省時且有效之放大技術。因 此，LAMP 技術對於感染性疾病的診斷，是一個非常有效率方法。
恆溫環狀擴增法(LAMP)主要是藉著內引子(inner primer)及外引子 (outer primer)引導 DNA 聚合酶催化而自動循環合成 DNA。在 LAMP 反應 中的特別之處在於引子的設計以及使用 Bst DNA 聚合酶。Bst DNA 聚合酶，
來自嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)，這是從一種由細菌所 純化生產的酵素，適合生存於 55℃到 65℃的高溫環境，並且可於此高溫 環境與引子對進行聚合作用，增幅出具有自我互補能力的 DNA 片段，形 成具有圈環的啞鈴型結構，因此在圈環的部分可再與內引子對接合藉此連 續且重複反應，進而產生大量的 DNA 片段。由於 Bst DNA 聚合酶缺乏 3’→5’
的 DNA 分解能力，在 DNA 聚合的過程中，只能將模版 DNA 上既有的互 補 DNA 鏈整條鏟起。這種聚合酶最主要的特性是具有非常強的的鏈置換 能力(strand displacement)，因此不需加熱就能使 DNA 雙股分離。
在初始的 LAMP 反應當中，如圖 2.9 所示，四個引子都參與其中，之 後只剩下內引子參與反應。內引子對包含前置內引子(forward inner primer, FIP)及後置內引子(backward inner primer, BIP)，兩者分別對應目標序列的
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兩段特定區域。如圖 2.9 所示，F2c 及 B2 為目標 DNA 序列的末端；F2c 及 B2 內側取兩段序列定義為 F1c 及 B1；外側則定義為 F3c 及 B3。FIP 由 F1c 及互補 F2c 的 F2 組成；BIP 包含互補 B1 的 B1c 及 B2；兩個外引子分 別是 B3 及 F3c。
圖2.9、目標(Target) DNA與引子(Primers) 示意圖
LAMP 技術在反應的過程中會有焦磷酸的釋放，與反應液中的鎂離子 會形成白色的焦磷酸鎂沉澱，隨著反應時間的增加，用肉眼即可觀察到大 量的白色沉澱物。為求效果，尚可加入核酸染劑，如溴化乙錠 (ethidium bromide, EtBr)與 SYBR Green I 等，接著使用 UV 照射來觀察反應結果，效 果比直接用肉眼觀察白色沉澱更佳。LAMP 技術發展至今十餘年，該技術 已成功被應用於肺結核菌[48]、SARS、禽流感、口蹄疫等疾病的檢測中。
在本論文中，我們將使用 LAMP 技術對肺結核桿菌(MTB)進行 DNA 增幅，
並藉由不需標定引子且具有高靈敏度的 SPR 檢測技術，對 MTB 進行快速 檢測，得到可能發病的 MTB-DNA 樣本濃度。
2.4.3 肺結核桿菌增幅方法比較
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傳統的結核病診斷方法包括痰液鏡檢(smear microscopy)、核酸增幅診 斷以及結核菌培養(mycobacterial culture)等方法。然而，這些診斷技術都各 具有一些缺點，因此並不普及。痰液鏡檢操作簡單，但靈敏性不高，而且 需要大量的樣品才能進行檢測(105 bacteria/mL) [49]；核酸增幅診斷之費用 過於昂貴；而結核分枝桿菌培養，由於分枝桿菌生長緩慢，因此必需六至 八周才可得到診斷結果[50-51]，上述缺點導致這些方法在立即診斷與治療 上受到限制。目前有許多檢測方法使用核酸放大為基礎的檢測系統，用於 直接檢驗臨床檢體中的結核分枝桿菌(MTBC) [52-54]，包括聚合酶連鎖反 應(PCR) [55]以及恆溫環狀擴增法(LAMP)等技術[56-59]。然而，傳統的 PCR 擴增的成本高，反應時間長仍然是此方法的主要問題。如表 2.5 所示，我 們分別比較痰液鏡檢、PCR 以及 LAMP 技術來放大核酸，比較結果顯示，
使用 LAMP 技術來放大核酸，無論在靈敏度或特異性上都優於其他方法，
因此，本論文將選擇以 LAMP 技術進行核酸放大。
表2.5、塗片顯微鏡、PCR以及LAMP之靈敏度與特異性等差異[50]
方法 靈敏度(%) 特異性(%) aNPV(%) bPPV(%)
Smear 80 100 85.8 100
PCR 91.6 95.9 93.3 94.8
LAMP 100 95.9 100 95.2
aNPV (Negative predictive value)為陽性預測值；bPPV (Positive predictive value)為陽性預測值
30 (Mycobacterium tuberculosis, MTB)，分別為：gyrB [48, 60]、16S rRNA [61] 、 rimM [62]以及 IS6110 [50, 58]。如表 2.6 所示，上述之四種 DNA 目標序列