石墨烯衍生物與生物感測器上之應用

石墨烯(graphene)是由碳原子以 sp²混成軌域呈蜂巢晶格排列構成的單 層二維晶體，其厚度約為一個碳原子厚度[22]。2004 年時，英國曼徹斯特 大學的安德烈·海姆(Andre Geim)以及康斯坦丁·諾沃肖洛夫(Konstantin Novoselov)成功地透過膠帶剝離的方法將石墨分離出單層的石墨烯，師徒 兩人也於 2010 年共同獲得諾貝爾物理學獎的殊榮[23]。

石墨烯目前已有三種衍生物，分別為石墨烯(Graphene)、石墨烯氧化物 (Graphene Oxide, GO)以及還原石墨烯氧化物 (reduced Graphene Oxide, rGO)。目前已有多篇將石墨烯衍生物應用於生物檢測上之文獻，本人將其 細分為：(1)以石墨烯為基礎之電化學生物感測器；(2)以石墨烯為基礎之表 面電漿子共振生物感測器；(3)以石墨烯氧化物為基礎之螢光生物感測器以 及(4)以還原石墨烯氧化物為基礎之場效電晶體生物感測器來分別討論。本 篇論文在此提出(5)以石墨烯氧化物為基礎之表面電漿子共振生物感測器，

並與上述四種生物感測器進行比較。

2.3.1 石墨烯(Graphene)

石墨烯可想像為由碳原子和其共價鍵所形成的原子尺寸網，被認為是 平面多環芳香烴原子晶體。由於石墨烯(Graphene)的高導電性與大表面與 體積比，石墨烯目前已經應用於光電元件、化學感測器、生物感測器與奈 米複合材料等相關應用上[24]。

以石墨烯為基礎之電化學生物感測器

2010 年，Lv 等人[25]使用非共價鍵的 π-π 堆疊法將石墨烯與 DNA 雜 合，並應用於玻璃碳電極上，稱為 GN/DNA-GC 電極，並針對 GN/DNA-GC

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電 極 與 傳 統 的 玻 璃 碳 電 極 的 實 驗 結 果 相 互 比 較 。 實 驗 結 果 顯 示 ， GN/DNA-GC 電極有更大的氧化還原電流與更佳的可逆性，其氧化還原峰 的電流約為傳統玻璃碳電極的 5 倍。使用 GN/DNA-GC 電極執行循環伏安 法的結果顯示一個幾乎對稱的氧化還原峰，這表示 GN/DNA-GC 電極上的 電子轉移率有著明顯的增強效果。因此，藉由石墨烯之大表面積檢測範圍 以及高靈敏度，GN/DNA-GC 電極具有更佳的檢測性。

以石墨烯為基礎之表面電漿子共振生物感測器

2010 年，Wu 等人[26]針對石墨烯表面電漿子共振技術進行模擬，該感 測器採用衰減全反射(Attenuated total reflectance, ATR)的方式來觀察感測 器表面生物分子之吸附所造成的折射率變化[27]。實驗數據與模擬結果一 致，單層石墨烯的穿透率約為 97.7%，代表一個原子厚的石墨烯層，將會 吸收 2.3%的入射光[28]。透過模擬數據也發現，每增加一層石墨烯層，其 穿透率會減少 2.3%。藉由模擬結果與實測光譜的一致性，Wu 等人開始對 石墨烯表面電漿子共振感測器進行光學行為之模擬。模擬結果顯示，石墨 烯薄膜 SPR 生物感測器之靈敏度優於傳統的黃金薄膜 SPR 生物感測器。

其靈敏度的增加是由於石墨烯吸附生物分子的增加以及石墨烯本身之光 學性質所致，因此石墨烯 SPR 生物感測器靈敏度的提升與石墨烯之層數呈 線性關係，其靈敏度最高可提升 25%。

2011 年 Choi 等人[29]使用銀作為基板進行 SPR 模擬，雖然銀的靈敏 度與效能皆優於以金，但銀容易氧化，造成銀基板無法進行表面再生 (regeneration)步驟，因此以銀為基板之 SPR 系統並不適合進行生物研究。

2012 年，Salihoglu 等人[30]成功地將石墨烯透過化學氣相沉積法

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(Chemical Vapor Deposition, CVD)塗佈於銅箔上[31]，並轉印至金膜與銀膜 表面，轉印後使用表面電漿子共振技術透過微流道系統研究石墨烯薄膜和 蛋白質之物理性交互作用。Salihoglu 等人將 SPR 角度固定在 49 度進行微 流道系統之即時檢測，透過不同濃度的牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)與石墨烯薄膜表面進行靜電吸附作用，微流道實驗過程約為一個半小 時，其曲線斜率記為結合常數(K_a)，約為 2.4×10^-5 M^-1 s^-1。Salihoglu 等人預 估石墨烯表面電漿子共振感測器可用來分析有機溶劑之吸附，進而廣泛應 用於環境維護與製藥工業上。

2.3.2 石墨烯氧化物(Graphene Oxide, GO)

石墨烯透過氧化及化學處理，使其漂浮在水中，透過此步驟，石墨烯 會剝落並形成有強力鍵的單層，其表面會被官能化，稱為石墨烯氧化物 (Graphene Oxide, GO) [32]。由於石墨烯氧化物具有易修飾的化學特性、在 水中的高分散性、大量的表面官能基等特性，因此石墨烯氧化物的應用範 圍相當廣泛。除了生物感測器的分子檢測與細胞成像應用之外[33-34]，亦 可有效地提升太陽電池效率，應用於太空電梯與纜線上，也可進行單分子 氣體偵測，或應用於透明導電電極上，作為超級電容器的材料等。

石墨烯氧化物(GO)的化學結構如圖2.8所示，其結構仍維持石墨烯的六 角形晶格結構，而石墨烯氧化物的表面缺陷以及邊界處，皆含有大量的含 氧官能基團。藉由Lucas等人[35]的分析結果顯示，環氧基(epoxy, C=O)、

羥基(hydroxyl, C-OH)、羧基(carboxyl, -COOH)以及羰基(carbonyl, C-O)皆分 佈於石墨烯氧化物之表面缺陷處以及其邊界處。石墨烯氧化物最大的優點 為其大量的表面官能基，經過活化作用後，可與生物分子緊密地鍵結，形 成強力的共價鍵。

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圖2.8、(a)石墨烯、(b)石墨烯氧化物之表面形態

目前有許多方法可以證明石墨烯氧化物(GO)的表面及邊緣存在著 -COOH 、 -OH 以 及 C=O 鍵 等 環 氧 官 能 基 群 ， 如 紅 外 光 光 譜 儀 (infrared spectroscopic, IR)、核磁共振光譜儀(nuclear magnetic resonance, NMR)以及 電子繞射技術(electron diffraction)等。由於GO的表面與邊緣具有大量的羧 基(-COOH)以及羥基(-OH)，因此，我們藉由此特性將GO視為介質，並與 後續生物分子如蛋白質、DNA等進行共價鍵結[36-37]。

以石墨烯氧化物為基礎之螢光生物感測器

1994 年 Kagan 等人 [38]提出螢光染料分子吸附在石墨塊上會導致淬 熄的結果，然而，石墨烯氧化物(GO)與還原氧化石墨烯(reduced Graphene Oxide, rGO) 之 SP²結構也會以類似的方式將螢光物質淬熄，如螢光染料以 及共軛聚合物[39-40]。雖然 GO 和 rGO 的淬熄效率之定量分析還有待據悉，

目前的研究結果顯示，GO 的淬滅效率是天然石墨的 10³倍大。此淬熄效應 來自於熒光物種和 GO 或 rGO 之螢光光共振能量轉移，或非輻射的偶極-偶極耦合所造成。

2010 年，Liu 等人[36]使用石墨烯氧化物之特性來探討石墨烯與 DNA 之雜合情形。當 DNA 探針與 GO 表面透過碳二亞胺(carbodiimide)化學雜

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合法與黃金奈米粒子標記的 DNA 鏈互補時，GO 陣列的熒光強度將會急劇 減少。此方法將導致黃金奈米粒子和 GO 薄膜之間的能量傳遞約有 87%的 熒光淬熄。此種大量的淬熄行為可歸因於螢光染劑和 GO 表面之間的長程 電子能量傳遞所造成。

在離子基團與芳香基族群的存在下，石墨烯氧化物(GO)可以以多種方 式與生物分子交互作用。存在 GO 平面跟邊緣的離子基團，使得帶電荷的 蛋白質與去氧核糖核酸(DNA)可以產生靜電力鍵結[40]，而芳香基族群對 GO 提供了一個 π-π 堆疊的平台並同時對染料淬熄。石墨烯氧化物表面之 羧酸基團也可被視為一個酸性樹脂，允許與帶電荷的分子交互作用，以形 成分子複合物。這些交互作用指出，生物分子的鍵結強度可由 GO 來調整，

提供了蛋白質研究之選擇的可能性。目前螢光淬滅的特性已被應用於石墨 烯氧化物光學感測器，用來檢測 DNA 和生物分子的交互作用[41]。

由上述實驗結果可知，我們可將石墨烯氧化物(GO)視為一個快速、高 靈敏度且具高選擇性的感測測層來檢測生物分子。由於石墨烯氧化物的低 成本與大表面積等特性，使得石墨烯氧化物生物感測器相當有應用空間。

2.3.3 還原石墨烯氧化物(reduced Graphene Oxide, rGO)

由於單層石墨烯(Graphene)的導電率取決於碳平面上載子的傳遞，而氧 化石墨烯(GO)的表面具有許多的含氧官能基，這些官能基對導電率會是個 很大的影響。而從圖 2.8 中可觀察到，平面上都是 -OH 與環氧基，邊緣是 -COOH 與 C=O，由於-COOH 與 C=O 存在於邊緣或是缺陷的地方，因此 對導電率的影響較小，因此 GO 要提升導電率，主要的目標就是去除 -OH 與環氧基。

23 物感測器的表現優於傳統的奈米碳管 FET 生物感測器。2011 年，Myung 等人[42]將還原的石墨烯氧化物(rGO)封裝於奈米粒子 FET 生物感測器，並 對於乳腺癌的主要標誌物，Human Epidermal growth factor Receptor 2 (HER2)以及 epidermal growth factor receptor (EGFR) [43]蛋白進行高靈敏度 檢測。實驗結果顯示，此 rGO 奈米粒子 FET 感測器只會針對 HER2 以及 EGFR 進行選擇性之交互作用[44]，可由相對電導率的改變來觀察。該感 測器之靈敏度相當高，HER2 檢測極限可達 1 pM，而 EGFR 則為 100 pM。

而 HER2 跟 EGFR 檢測極限的不同是因為這兩個蛋白對單株抗體之親和力

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的不同所導致。此生物感測器有高靈敏度以及選擇性能力來檢測不同的生 物樣品。由於石墨烯-奈米粒子之 FET 生物感測器之生物相容性，並具有 良好的電化學和的電性能，使得石墨烯 FET 生物感測器未來在臨床應用上 相當有發展性。

2.3.4 以石墨烯氧化物為基礎之表面電漿子共振生物感測器 以石墨烯氧化物為基礎之表面電漿子共振生物感測器

本論文提出石墨烯氧化物薄膜於表面電漿子共振生物感測器之研發，

係ㄧ種以石墨烯氧化物為感測層之表面電漿子共振生物感測器。將石墨烯 氧化物(GO)透過化學修飾固定在金膜表面，並透過表面電漿子共振技術進 行檢測。此技術利用表面電漿子共振免標記、即時檢測之特性，並加上石 墨烯氧化物表面大量的含氧官能基，有利於與生物分子共價鍵結等特性，

為一項相當有發展前景之生醫檢測技術。而表 2.4 也針對目前石墨烯相關 的生物感測器進行優缺點比較。

目前國內外尚未有實驗室提出此整合物理、化學以及生物學之跨領域 應用，本實驗室將首開先例設計並執行此實驗，因此，本論文之石墨烯氧 化物薄膜的研發為一相當具有前瞻性與應用價值之實驗。

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表 2.4、以石墨烯為材料應用於生物感測器之比較

表 2.4、以石墨烯為材料應用於生物感測器之比較