第四章 石墨烯氧化物薄膜透過表面電漿子共振技術檢測生物樣本 45
4.2 實驗方法
4.2.4 表面電漿子共振(SPR)微流道系統實驗
如 圖 4.1 所 示 ， 本 實 驗 使 用 表 面 電 漿 子 共 振 微 流 道 系 統 (BI-SPR Instrument, BI-3000G, 670 nm 紅光雷射)即時檢測傳統金膜以及石墨烯氧 化物薄膜表面與生物分子交互作用的情形。
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圖 4.1、(a) 傳統金膜與 BSA 以及(b) GO 薄膜與 BSA 之 SPR 微流道系統示 意圖。1: MOA, 2: BSA, 3: Cys, 4: GO
將傳統金膜以及GO薄膜透過耦合油與稜鏡表面耦合後，分別置入SPR 系統內並進行實驗，實驗預先處理步驟如下所示：
步驟一：Purge
以去離子水作為實驗溶液，並以150 µg/ml之流速對流道系統進行Purge，
此步驟可避免管路內空氣殘留的問題。待Purge步驟完成後，將流速設定為 60 µg/ml，即可進行系統校正。
步驟二： SPR 系統校正
透過去離子水與酒精混合，得到濃度為1%的酒精溶液，並將其注入SPR系 統進行校正。校正原因係將濃度為1%的酒精反應量控制為相同(60 mDeg.)，
將其作為數據間互相比較之基準。
步驟三：注入欲測實驗樣品，進行SPR即時檢測。
4.2.4.1 分子自組裝單層膜(SAM)時間最佳化
一般來講，常見分子自組裝單層膜的最佳時間約為24小時左右[74-75]。
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為求嚴謹，我們將GO薄膜之SAM時間分別設定為30分鐘、5小時、12小時 以及24小時後，與濃度為2 mg/ml 的GO水溶液共價鍵結，形成不同SAM 條件的GO薄膜(2 mg/ml)。接著再透過這些不同SAM條件的GO薄膜與不同 濃度的BSA進行共價鍵結，分別為100 µg/ml、10 µg/ml以及1 µg/ml。藉由 此實驗觀察何種SAM時間條件下得到的GO薄膜之靈敏度最佳。
4.2.4.2 胱胺與石墨烯氧化物之濃度最佳化
為了製造出靈敏度最佳的GO薄膜，胱胺水溶液以及GO水溶液的濃度 是非常重要的兩項控制變因。因此，我們設定三種胱胺溶液的濃度，分別 為1 mM、5 mM以及10 mM [76-78]，同時也設定三種GO溶液的濃度，分別 為0.275 mg/ml、1 mg/ml以及2 mg/ml。經由這兩項條件設定，再透過SPR 技術檢測薄膜對濃度為100 µg/ml之BSA的SPR角之表現，即可得到靈敏度 最佳之石墨烯氧化物薄膜。
4.2.4.3 石墨烯氧化物薄膜表面官能基之影響
為了確認石墨烯氧化物薄膜是透過 GO 表面的官能基與測量之生物分 子共價鍵結，而非透過靜電力等方式與生物分子鍵結。在此，我們設定此 實驗，透過表面不含官能基之石墨烯(Graphene)與胱胺水溶液鍵結，形成 石墨烯生物晶片。同時也透過循環伏安法(Cyclic Voltammetry)對石墨烯氧 化物薄膜進行還原反應，得到還原石墨烯氧化物(reduced Graphene Oxide, rGO)薄膜。藉由石墨烯氧化物薄膜，加上石墨烯衍生物之生物晶片(石墨烯 薄膜與還原石墨烯氧化物薄膜)，我們可清楚地了解 GO 薄膜生物晶片是否 係透過官能基與生物分子共價鍵結。我們亦使用 XPS 系統以及 Raman 系 統來觀察 G / GO / rGO 薄膜之差異，並確認 GO 薄膜是否順利地還原為 rGO 薄膜。
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實驗所使用之 G / GO / rGO 薄膜濃度皆為 2 mg/ml，與濃度為 100 μg/ml 之牛血清白蛋白進行鍵結反應，並透過 SPR 即時檢測三種晶片鍵結之 SPR 角的差異，觀察 SPR 鍵結量與表面官能基的關係。
循環伏安法對石墨烯氧化物薄膜之還原條件
還原圈數為 50 cycle；還原溶液為濃度為 0.5 M 之 NaCl；掃描電位為 -1.1(v) ~0.7(v)；掃描速率為 50 (mV/s)。
4.2.4.4 表面電漿子共振系統流速最佳化
在 SPR 微 流 道 實 驗 中 ， 由 於 需 要 設 定 鍵 結 (Association) 與 解 離 (Dissociation)的時間，因此樣品流過欲測金膜表面的流速對於檢測結果來 說影響甚大。在此，我們設定三種實驗流速，分別為 30 µL/min、60 µL/min 以及 90 µL/min，觀察流速對 SPR 角與動力學分析所造成的影響。由於先 前實驗已測出 5 mM 的胱胺溶液以及 2 mg/ml 的 GO 水溶液所形成的 GO 薄膜靈敏度最佳，因此我們使用此條件下的 GO 薄膜與濃度為 100 µg/ml 的 BSA 執行此實驗。
4.2.4.5 表面電漿子共振即時檢測
在先前的實驗中，我們已得到GO薄膜的最佳化製作條件以及最佳的流 速條件。因此，在此部份我們將比較不同濃度的GO薄膜(2 mg/ml, 1 mg/ml, 以及0.275 mg/ml)之靈敏度差異，並與傳統金膜做比較，觀察靈敏度是否與 石墨烯氧化物水溶液有關。本實驗之流速為60 µL/min；使用pH值為7.4 的 1X phosphate buffer saline (PBS)作為緩衝液；使用濃度為1%的酒精作為校 正溶液；使用EDC(0.4 M)混合NHS(0.1 M)作為活化生物連接物之試劑[79]；
待測生物樣本為牛血清白蛋白(BSA)，濃度由100 µg/ml (~1.67 µM)至100
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pg/ml (~1.67 pM)。實驗程序如下：
步驟一：以1X PBS 溶液做為緩衝液，等待SPR角穩定；
步驟二：使用1%酒精進行校正，利於數據間的互相比較；
步驟三：注入EDC/NHS 將欲測金膜之表面官能基活化；
步驟四：注入不同濃度的 BSA，觀察 SPR 角的差異。
4.2.4.6 動力學分析
使用 GO 薄膜與傳統金膜分別與濃度為 100 µg/ml 的牛血清白蛋白 (BSA)鍵結，並即時觀察鍵結時金膜表面與 BSA 之結合常數(Association constant, KA)與解離常數(Dissociation constant, KD)的差異。
4.2.4.7 牛血清白蛋白免疫反應分析
使用牛血清白蛋白(BSA)與牛血清白蛋白抗體(Anti-BSA)進型免疫反 應，並透過靈敏度較高的 GO 薄膜(2 mg/ml)以及傳統金膜進行比較，觀察 不同金膜對免疫反應造成的差異。本實驗之流速為 60 µL/min；使用 pH 值 為 7.4 的 1X phosphate buffer saline (PBS)作為緩衝液；使用濃度為 1%的酒 精作為校正溶液；使用 EDC(0.4 M)混合 NHS(0.1 M)作為活化生物連結物 之試劑；使用濃度為 100 µg/ml 的牛血清白蛋白(BSA)作為免疫作用之受體；
使用 pH 值為 8.0、濃度為 1 M 之乙醇胺(Ethanolamine, EA)填充晶片表面 之空缺；使用濃度為 50 mM 之氫氧化鈉(NaOH)作為解離劑，清洗金膜表 面[80-81]。實驗程序如下：
步驟一：以1X PBS 溶液做為緩衝液，等待SPR角穩定；
步驟二：使用1%酒精進行校正，利於數據間的互相比較；
步驟三：注入EDC/NHS 將欲測金膜之表面官能基活化；
步驟四：注入牛血清白蛋白(BSA, 100 µg/ml)，作為免疫反應之受體；
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步驟五：注入乙醇胺(EA, 1M)，填滿表面經活化後未與 BSA 鍵結的部分；
步驟六：注入 NaOH (50 mM)，將表面鍵結效果較差的部份解離掉；
步驟七：依序注入牛血清白蛋白抗體(Anti-BSA, 1µg/ml, 5µg/ml, 10µg/ml, 25µg/ml, 50µg/ml, 100µg/ml)，進行免疫反應；
步驟八：注入 NaOH (50 mM)，將表面之 Anti-BSA 清洗掉，以利再接上不
200 400 600 800 1000
0
480 490 500 510 520 530
7.5
Wavelength: 504 nm
Relative transmittance
Wavelength (nm)
bare Au film Au-Cys film (5 mM) GO sheets (0.275 mg/ml) GO sheets (1 mg/ml) GO sheets (2 mg/ml)
圖4.2、黃金薄膜、胱胺薄膜以及濃度分別為0.275 mg/ml、1 mg/ml 以及2 mg/ml 的GO薄膜之穿透光譜圖