石墨烯氧化物薄膜於表面電漿子共振生物感測器之研發

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(1)國立臺灣師範大學光電科技研究所碩士論文 Institute of Electro-Optical Science and Technology National Taiwan Normal University. 石墨烯氧化物薄膜於表面電漿子共振生物感測器之研發 Development of Graphene Oxide Sheets for Surface Plasmon Resonance Biosensors. 指導教授：邱南福. 博士. 研究生：黃騰毅. 中華民國. 一○二. 年六月.

(2) 致謝本論文之相關研究工作可以順利進行並且告一段落，是經由許多人協助幫忙而完成。首先要感謝我的指導老師邱南福教授，從我考上師大光電所至今兩年多來對我的諄諄教誨，讓我有機會接觸並進行新穎的學術研究，並漸漸地懂得研究工作的樂趣與迷人之處；老師對實驗發展及想法總是走在目前研究的最前端，往往能明確地指出我該往哪個方向進行以及目前所缺少的想法，也不斷傳授我研究上正確的觀念以及應有的態度。老師創造了一個相當自由且資源豐富的實驗環境，在此也感謝老師總是容忍我專業知識上的不足，不但沒有放棄我，而且還不時地砥礪我，讓學生得以慢慢成長，也得以完成此一論文。. 衷心感謝台灣大學醫學工程學研究所林啟萬教授以及長庚大學醫學生物技術暨檢驗學系賴信志教授兩位口試委員不吝指正，提供許多寶貴的意見，使學生的論文可以更趨於完整；經由此次經驗，學生深深地感受到跨領域合作的有利之處，感謝兩位口試委員啟發學生對於本研究的不同想法，使學生能夠立刻找出研究不足之處。感謝台灣大學林啟萬教授不吝提供實驗所需之光學量測儀器與設備、感謝長庚大學賴信志教授，對於本研究中相關的DNA增幅知識之教導，以及不吝提供實驗所需之設備與藥品樣本，這些重要資源皆為本研究工作得以順利進行的關鍵。. 在完成本論文的過程中，還有許多學長姐、同學、學弟妹的協助，在此也一併感謝。感謝台大醫工所林啟萬教授所提供的數位顯微鏡系統，並感謝台大學醫工所魏志中學長協助量測數位顯微鏡；感謝台大醫工所游濬博士協助本實驗室撰寫多功能電漿量測系統之LabView控制程式，並提供 i.

(3) 寶貴意見供實驗室成員參考；感謝長庚大學賴信志教授實驗室助理謝敏華學姐與林宜佳學姐在DNA增幅與檢測技術以及生物分子方面的耐心指導，並協助增幅以及判讀DNA增幅結果；感謝台大光電所電子束實驗室所提供的電子束微影系統，並感謝臺師大光電所鄭智仁同學與劉靖達學弟協助量測掃描電子顯微鏡之實驗；感謝臺師大物理系賈至達教授所提供的Raman 系統，同時感謝臺師大物理系呂杰翰博士協助量測Raman光譜，並與本人分享研究路上的經驗，使本人受益良多；感謝臺師大化學系洪偉修教授所提供的XPS系統，並感謝臺師大化學系陳誌濠同學協助量測XPS。感謝一路走來的實驗室同學們，你們大家無論在課業或生活上都是我的好夥伴；總而言之，謝謝你們大家。. 最後，我要感謝我的家人，因為有你們的支持與鼓勵，讓我能順利克服學業上以及生活上的瓶頸；你們也教導我做人處事的道理，以及積極正向的人生態度，在求學的過程中也不吝給予鼓勵，讓我在挫折中重新燃起希望，在研究失敗或錯誤後能更努力且更積極地重新振作起來。感謝所有人的鼓勵使我能夠順利完成學業。. ii.

(4) 中文摘要表面電漿子共振(Surface plasmon resonance, SPR)生物感測器為利用金膜表面與生物分子交互作用所造成的微量折射率變化，進而達到免標記且高靈敏度之檢測技術，為目前光學式生物感測技術中的重要方法之一。. 本論文將石墨烯氧化物(Graphene oxide, GO)鍵結於黃金薄膜上，所得到的薄膜稱為石墨烯氧化物薄膜，並透過表面電漿子共振生物感測技術，將此薄膜應用於生物感測上。石墨烯氧化物薄膜的製作首先將胱胺二鹽酸 (Cystamine, Cys)作為連接劑，並透過分子自組裝單層膜(Self-assembled monolayer, SAM)技術，將胱胺鍵結於金膜上，形成胱胺薄膜。接著將石墨烯氧化物以共價鍵結的方式固定於胱胺薄膜表面，形成石墨烯氧化物薄膜 (GO sheets)。論文中利用本實驗室之 SPR 量測系統並透過牛血清白蛋白與肺結核桿菌等生物分子進行檢測，並比較石墨烯氧化物薄膜與傳統金膜之靈敏度、檢測極限以及動力學分析結果之差異。. 本論文發展之石墨烯氧化物薄膜表面電漿子共振生物感測器，與傳統金膜比較後，石墨烯氧化物薄膜之靈敏度約可提升 12 倍，檢測極限與動力學分析後之結果亦皆優於傳統金膜。最重要的是，石墨烯氧化物薄膜可直接透過官能基與生物分子鍵結，不必再透過抗原抗體的交互作用來執行，因此可有效地降低檢測成本。未來本系統除了可供醫學與疾病檢測外，亦可應用於製藥工業、環境檢測、農業科技等領域之分析應用，以造福人群。. 關鍵詞：表面電漿子共振、分子自組裝單層膜、石墨烯氧化物、動力學分析、肺結核桿菌 iii.

(5) Abstract The advantage of surface plasmon resonance (SPR) biosensors includes high sensitivity, label-free, and real-time detection. These advantage leading SPR biosensors to identified as one of the most important optical detection methods for biomolecules.. The goal of this thesis is to develop graphene oxide (GO) sheets SPR biosensor that used GO as sensing layer for biomolecules detection. First, we used cystamine as linker layer, forming Cys film by self-assembled monolayer (SAM) technique. Then, GO solution was immobilized on the surface of Cys film through covalent attachment, forming GO sheets. The GO sheets SPR biosensor was used to detect the dynamic interactions of biomolecules and antibody-antigen. For experimental verification of this system, bovine serum albumin (BSA) and LAMP DNA products were used to demonstrate by GO sheets and conventional Au films. We also compared these two films by sensitivity, detection limits and kinetic analysis.. The sensitivity of GO sheets that can be determined by this thesis is about 12-fold higher than that obtained with the sensor based on conventional Au films. The detection limits and the results of kinetic analysis of GO sheets were also better than conventional Au films. Most important of all, GO sheets have the ability for directly detect biomolecules, skipped the immunization interactions, leading to a low cost experiment. We anticipate that graphene oxide sheet SPR biosensors will not only enable for possible applications for iv.

(6) biomedicine and diseases but also have wide spectrum of application in pharmaceutical industry, environmental monitoring, and agriculture in the near future.. Keywords: Surface plasmon resonance, Self-assembled monolayer, Graphene oxide, Kinetic analysis, Mycobacterium tuberculosis. v.

(7) 目錄致謝..............................................................................................................i 中文摘要................................................................................................... iii Abstract ......................................................................................................iv 目錄............................................................................................................vi 圖目錄...................................................................................................... xii 表目錄....................................................................................................... xv 第一章緒論............................................................................................... 1 1.1 前言 .................................................................................................. 1 1.2 研究動機與目標 .............................................................................. 1 1.3 論文架構 .......................................................................................... 2 第二章基本原理與文獻回顧 .................................................................. 4 2.1 表面電漿子共振原理 ...................................................................... 4 2.1.1 表面電漿波 ......................................................................... 4 2.1.2 表面電漿子共振 ................................................................. 5 2.1.3 表面電漿子共振之激發 ..................................................... 7 2.1.4 表面電漿子共振之光學感測 ............................................. 8 vi.

(8) 2.1.5 表面電漿子共振生物感測器 ........................................... 10 2.2 表面電漿子共振金膜之固定化 .................................................... 11 2.2.1 金膜之表面修飾 ............................................................... 11 2.2.2 分子固定化技術 ............................................................... 14 2.3 石墨烯衍生物與生物感測器上之應用 ........................................ 18 2.3.1 石墨烯(Graphene) ............................................................. 18 2.3.2 石墨烯氧化物(Graphene Oxide, GO) .............................. 20 2.3.3 還原石墨烯氧化物(reduced Graphene Oxide, rGO) ....... 22 2.3.4 以石墨烯氧化物為基礎之表面電漿子共振生物感測器 ...................................................................................................... 24 2.4 肺結核的診斷與恆溫環狀擴增法 ................................................ 26 2.4.1 肺結核的診斷 ................................................................... 26 2.4.2 恆溫環狀擴增法 ............................................................... 26 2.4.3 肺結核桿菌增幅方法比較 ............................................... 28 2.4.4 肺結核桿菌 DNA 序列 IS6110 ........................................ 30 2.5 分子動力學分析 ............................................................................ 30 2.5.1 分子動力學方程式 ........................................................... 30 vii.

(9) 2.5.2 質傳效應 ........................................................................... 34 第三章實驗材料、儀器設備與研究方法 ............................................ 36 3.1 實驗材料 ........................................................................................ 36 3.2 儀器設備 ........................................................................................ 38 3.3 多功能電漿量測系統架構 ............................................................ 40 3.4 表面電漿子共振感測晶片製作 .................................................... 43 第四章石墨烯氧化物薄膜透過表面電漿子共振技術檢測生物樣本 45 4.1 實驗目的 ........................................................................................ 45 4.2 實驗方法 ........................................................................................ 45 4.2.1 實驗溶液配製 ................................................................... 45 4.2.2 金膜固定化之檢測 ........................................................... 46 4.2.2.1 穿透光譜系統實驗 ................................................. 46 4.2.2.2 數位顯微鏡系統實驗............................................. 46 4.2.2.3 掃描電子顯微鏡(SEM)系統實驗.......................... 47 4.2.3 多功能電漿量測系統(MPS)實驗 .................................... 47 4.2.4 表面電漿子共振(SPR)微流道系統實驗 ......................... 47 4.2.4.1 分子自組裝單層膜(SAM)時間最佳化 ................. 48 viii.

(10) 4.2.4.2 胱胺與石墨烯氧化物之濃度最佳化..................... 49 4.2.4.3 石墨烯氧化物薄膜表面官能基之影響................. 49 4.2.4.4 表面電漿子共振系統流速最佳化......................... 50 4.2.4.5 表面電漿子共振即時檢測..................................... 50 4.2.4.6 動力學分析 ............................................................. 51 4.2.4.7 牛血清白蛋白免疫反應分析................................. 51 4.3 實驗結果與討論 ............................................................................ 52 4.3.1 金膜固定化之檢測結果 ................................................... 52 4.3.1.1 穿透光譜系統實驗結果......................................... 52 4.3.1.2 數位顯微鏡系統實驗結果..................................... 53 4.3.1.3 掃描電子顯微鏡(SEM)系統實驗結果.................. 53 4.3.2 多功能電漿量測系統(MPS)實驗結果 ............................ 54 4.3.3 表面電漿子共振(SPR)微流道系統實驗結果 ................. 56 4.3.3.1 分子自組裝單層膜(SAM)時間最佳化結果 ......... 56 4.3.3.2 胱胺與石墨烯氧化物之濃度最佳化結果 ............ 57 4.3.3.3 石墨烯氧化物薄膜表面官能基之影響結果 ........ 58 4.3.3.4 表面電漿子共振系統流速最佳化結果................. 61 ix.

(11) 4.3.3.5 表面電漿子共振即時檢測結果............................. 63 4.3.3.6 動力學分析結果 ..................................................... 67 4.3.3.7 牛血清白蛋白免疫反應分析結果......................... 69 第五章石墨烯氧化物薄膜透過表面電漿子共振技術檢測肺結核桿菌 ................................................................................................................... 72 5.1 肺結核桿菌簡介 ............................................................................ 72 5.2 實驗目的 ........................................................................................ 72 5.3 實驗方法 ........................................................................................ 73 5.3.1 實驗溶液配製 ................................................................... 73 5.3.2 實驗樣品設計條件 ........................................................... 74 5.3.3 凝膠電泳對 TB-DNA 樣本之檢測 .................................. 75 5.3.4 圓漬點墨法對地高辛精(Dig)之免疫反應檢測 .............. 76 5.3.5 表面電漿子共振(SPR)微流道系統實驗 ......................... 77 5.3.5.1 透過 Digoxigenin 抗體進行免疫分析法............... 77 5.3.5.2 設計不同 LAMP 產物與 GO 薄膜交互作用........ 80 5.4 實驗結果與討論 ............................................................................ 82 5.4.1 凝膠電泳對 TB-DNA 樣本之檢測結果 .......................... 82 x.

(12) 5.4.2 圓漬點墨法對地高辛精(Dig)之免疫反應檢測結果 ....... 85 5.4.3 表面電漿子共振(SPR)微流道系統實驗結果 ................. 86 5.4.3.1 透過 Digoxigenin 抗體進行免疫分析法之結果 .. 86 5.4.3.2 設計不同 LAMP 產物與 GO 薄膜交互作用之結果 ................................................................................................ 90 第六章結論與未來展望 ........................................................................ 93 6.1 結論 ................................................................................................ 93 6.2 未來展望 ........................................................................................ 94 參考文獻................................................................................................... 95. xi.

(13) 圖目錄圖2.1、在. 與. 空間，介面上表面電漿波(SPW)被激發的情形。. 圖2.2、表面電漿之色散曲線圖。圖2.3、稜鏡耦合式表面電漿子共振架構：(a) Otto 架構，在稜鏡與金屬之間有一厚度極小之空氣層；(b) Kretschmann 架構，直接將金屬鍍於稜鏡上。圖2.4、分子自組裝單層膜(SAM)技術之示意圖。圖2.5、分子吸附在基板表面的SAM薄膜結構圖。圖2.6、不同的固定化方法及欲測薄膜表面分子鍵結示意圖。圖2.7、透過EDC/NHS 活化羧基群之流程示意圖。圖2.8、(a)石墨烯、(b)石墨烯氧化物之表面形態。圖2.9、目標(Target) DNA與引子(Primers)示意圖。圖 2.10、以表面電漿子共振量測生物實驗所得之反應曲線圖。圖 2.11、利用 Req/C 對 Req 作圖所得之親和力常數。圖 2.12、濃度值 S 對反應物的濃度 C 作圖。圖2.13、BI-SPR系統建議執行實驗之流速。圖3.1、多功能電漿量測系統(MPS)架構示意圖。圖3.2、多功能電漿量測系統(MPS)架構實體圖。圖3.3、多功能電漿量測系統(MPS)之CCD與旋轉台稜鏡系統實體圖。圖3.4、傳統金膜(MOA films)與石墨烯氧化物薄膜(GO sheets)之製作過程。圖 4.1、(a) 傳統金膜與 BSA 以及(b) GO 薄膜與 BSA 之 SPR 微流道系統示意圖。1: MOA, 2: BSA, 3: Cys, 4: GO。圖4.2、黃金薄膜、胱胺薄膜以及濃度分別為0.275 mg/ml、1 mg/ml 以及2 mg/ml 的GO薄膜之穿透光譜圖。圖4.3、黃金薄膜、Cys薄膜以及GO薄膜之數位顯微鏡量測圖。 xii.

(14) 圖4.4、使用掃描電子顯微鏡觀察GO薄膜之表面型態。圖4.5、使用多功能電漿量測系統(MPS)分別量測黃金薄膜、Cys薄膜以及濃度為0.275 mg/ml、1 mg/ml 以及2 mg/ml 的GO薄膜之SPR圖。圖4.6、使用MPS分別量測GO薄膜(2 mg/ml)、活化後的GO薄膜以及與濃度為100 µg/ml的BSA鍵結後之GO薄膜。圖4.7、透過濃度為5 mM的胱胺水溶液之不同SAM時間形成的GO薄膜，觀察GO與三種BSA濃度(1 µg/ml, 10 µg/ml與100µg/ml)的SPR角變化趨勢。圖4.8、使用不同濃度的的胱胺水溶液與石墨烯氧化物水溶液對金膜作修飾，並透過濃度為100 µg/ml的BSA進行最佳化測試。圖4.9、透過Raman系統觀察G / GO / rGO薄膜之差異。圖4.10、透過XPS系統觀察GO薄膜與rGO薄膜之差異。圖4.11、透過SPR系統即時檢測不同薄膜與BSA鍵結之結果。圖4.12、胱胺薄膜、石膜烯薄膜、石墨烯氧化物薄膜以及還原石墨烯氧化物薄膜與BSA鍵結之SPR角。圖4.13、不同流速對於GO薄膜(2 mg/ml)與BSA(100 µg/ml) 之SPR角的影響。虛線為動力學分析之擬合曲線。圖4.14、不同流速對於GO薄膜(2 mg/ml)與BSA(100 µg/ml)之結合常數 (Association constant, KA)與解離常數(Dissociation constant, KD)之影響。圖4.15、GO薄膜(2 mg/ml)與不同濃度的BSA之SPR即時檢測圖。圖4.16、GO薄膜(1 mg/ml)與不同濃度的BSA之SPR即時檢測圖。圖4.17、GO薄膜(0.275 mg/ml)與不同濃度的BSA之SPR即時檢測圖。圖4.18、傳統金膜與不同濃度的BSA之SPR即時檢測圖。圖4.19、GO薄膜與傳統金膜對牛血清白蛋白(BSA)之SPR連續檢測圖。圖4.20、GO薄膜與傳統金膜對不同濃度的BSA之SPR角指數擬合圖。圖4.21、GO薄膜與傳統金膜對BSA之動力學擬合圖。 xiii.

(15) 圖4.22、GO薄膜與傳統金膜對不同濃度的BSA之動力學分析圖。圖4.23、GO薄膜-BSA對不同濃度的Anti-BSA之SPR即時檢測。圖4.24、傳統金膜-BSA對不同濃度的Anti-BSA之SPR即時檢測。圖4.25、GO薄膜與傳統金膜分別進行抗原-抗體SPR即時檢測。圖5.1、經核酸放大之Dig分子與DNA序列腺嘌呤(A)鍵結反應。圖5.2、透過PCR技術將TB-DNA樣本標記上抗原(Dig)，利用抗原-抗體的免疫反應經由SPR技術進行快速檢測。圖 5.3、石墨烯氧化物薄膜檢測 MTB 之流程圖。圖5.4、TB-DNA樣本經由凝膠呈像系統顯示之跑膠結果。圖5.5、將TB-DNA樣本分別稀釋至1X、25X以及100X後，透過凝膠呈像系統顯示之跑膠結果。圖5.6、LAMP擴增一小時之產物，肺結核桿菌(MTB)以及陰性對照組(NC)，經由凝膠呈像系統顯示其跑膠結果。圖 5.7、透過圓漬點墨法判讀 TB-DNA 樣本之增幅結果。圖 5.8、增幅一小時與兩小時之 TB-DNA 樣本，Dig labeled DNA，稀釋 25X 與 100X 後與 Digoxigenin 抗體進行免疫反應之 SPR 即時檢測。圖 5.9、增幅一小時與兩小時之 TB-DNA 樣本，unlabeled DNA，稀釋 25X 與 100X 後與 Digoxigenin 抗體進行免疫反應之 SPR 即時檢測。圖 5.10、增幅一小時與兩小時之 TB-DNA 樣本，NO DNA template，稀釋 25X 與 100X 與 Digoxigenin 抗體進行免疫反應之 SPR 即時檢測。圖 5.11、增幅一小時與兩小時之 TB-DNA 樣本，稀釋 25X 與 100X 後，與 Digoxigenin 抗體進行免疫反應之 SPR 角比較圖。圖 5.12、GO 薄膜對肺結核桿菌(MTB)與陰性對照組(NC)之 SPR 即時檢測。圖 5.13、GO 薄膜對肺結核桿菌(MTB)與陰性對照組(NC)之指數擬合圖。. xiv.

(16) 表目錄表2.1、不同調變方式之解析度比較。表 2.2、電化學還原與熱退火還原法優缺點比較。表 2.3、調控 GO 還原程度的比較表。表 2.4、以石墨烯為材料應用於生物感測器之比較。表2.5、塗片顯微鏡、PCR以及LAMP之靈敏度與特異性等差異。表2.6、目前已成功透過LAMP擴增MTB之DNA序列。表3.1、多功能電漿量測系統(MPS)元件規格表。表4.1、使用濃度為100 µg/ml的BSA對不同濃度的胱胺水溶液與石墨烯氧化物水溶液進行最佳化測試。表4.2、動力學分析不同流速對GO薄膜(2 mg/ml)與BSA(100 µg/ml)之影響。表4.3、GO薄膜與傳統金膜對不同濃度BSA的SPR鍵結角。表4.4、GO薄膜與傳統金膜之動力學分析表。表4.5、GO薄膜與傳統金膜分別進行抗原-抗體反應之SPR鍵結角。表5.1、 IS6110-LAMP引子設計。表5.2、設計三種不同條件之TB-DNA樣本。表 5.3、肺結核桿菌(MTB)以及陰性對照組(NC)之成分表。表5.4、Dig labeled DNA與Digoxigenin抗體之SPR免疫反應結果。表5.5、unlabeled DNA與Digoxigenin抗體之SPR免疫反應結果。表5.6、NO DNA template與Digoxigenin抗體之SPR免疫反應結果。表 5.7、GO 薄膜對肺結核桿菌(MTB)與陰性對照組(NC)之 SPR 角。. xv.

(17) 第一章緒論 1.1 前言石墨烯，為近年來被熱烈討論且應用範圍相當廣泛之新穎材料。2004 年時，英國曼徹斯特大學的安德烈·海姆(Andre Geim)以及康斯坦丁·諾沃肖洛夫(Konstantin Novoselov)成功地將石墨透過膠帶剝離的方法分離出單層的石墨烯，師徒兩人也於 2010 共同獲得諾貝爾物理學獎的殊榮。在此之後，與石墨烯相關的論文如雨後春筍般大量湧出，與石墨烯相關的衍生物亦被證實出來，包括了表面含有大量官能基的石墨烯氧化物(Graphene oxide, GO)以及將石墨烯之價電帶與導電帶分離的還原石墨烯氧化物 (reduced Graphene oxide, rGO)。. 表面電漿子共振(surface plasmon resonance, SPR)生物感測器，是利用欲測分子與生物晶片表面上之交互作用，並透過表面電漿子共振角的變化來進行即時檢測的方法，也是目前最熱門的檢測方式。由於 SPR 技術具有快速、即時檢測(real-time)、高靈敏度(high sensitivity)、免標記(lable-free)，以及可進行動力學分析(kinetic analysis)等優點，因此成為最具發展濳力的檢測技術，係生物醫學研究上不可或缺的利器。. 1.2 研究動機與目標目前以石墨烯相關材料為基礎之生物感測器已被大量提出，包含以石墨烯氧化物為基礎之螢光生物感測器、以石墨烯為基礎之電化學生物感測器、以還原石墨烯氧化物為基礎之場效電晶體生物感測器等生物感測器等。上述的生物感測器由於皆需要事先對欲偵測之生物分子進行螢光標記 (labeling)的動作，且無法即時檢測生物分子交互作用的反應情形，因此在 1.

(18) 本論文中，我們使用免標記並可進行即時檢測的表面電漿子共振技術來檢測生物分子間的交互作用。. 本論文提出在傳統的 SPR 檢測技術下，將石墨烯氧化物(GO)透過分子自組裝單層膜(SAM)技術得到石墨烯氧化物薄膜，並與欲測生物分子交互作用，將其結果與傳統金膜互相比較後，預計 GO 薄膜之靈敏度將會有顯著的提升。本論文主要透過胱胺鹽酸(Cystamine, Cys)作為連接層，將石墨烯氧化物水溶液與金膜鍵結，並使用掃描電子顯微鏡(Scanning Electron Microscopy, SEM)與紅外光-可見光穿透光譜等量測系統來確認是否順利製作出 GO 薄膜，並研發出最佳化的 GO 薄膜來進行表面電漿子共振檢測。本論文所製作的石墨烯氧化物薄膜之檢測原理主要是透過石墨烯氧化物薄膜之高靈敏度與表面大量的含氧官能基，如羥基(hydroxyl, -OH)與羧基 (carboxyl, -COOH)等，經由活化步驟後，將石墨烯氧化物表面之官能基與欲測分子表面的官能基，如胺基(amino group, -NH2)等進行共價鍵結，並藉由 SPR 技術即時檢測其交互作用。. 期望本論文提出之石墨烯氧化物薄膜表面電漿子共振生物感測器的檢測極限能優於現有的檢測晶片，並能有效改善現有檢測技術之靈敏度，並將本石墨烯氧化物薄膜應用於製藥工業、環境檢測、農業科技等技術上，對本領域之研究方向有所貢獻。. 1.3 論文架構本論文第一章為緒論，主要敘述本論文之研究動機與目標。第二章主要分別介紹表面電漿子共振技術的原理、石墨烯氧化物特性、恆溫環狀擴增法的原理、表面電漿子共振技術於生物檢測上之應用領域，以及簡述動 2.

(19) 力學分析之原理。第三章列出了實驗藥品與儀器設備。第四章，透過胱胺 (Cystamine, Cys)與石墨烯氧化物鍵結，形成石墨烯氧化物薄膜(GO sheets)。透過表面電漿子共振技術即時檢測技術檢測石墨烯氧化物薄膜與生物分子之交互作用，並與傳統金膜進行靈敏度及檢測極限的比較。最後再對石墨烯氧化物薄膜與傳統金膜進行動力學分析以及免疫反應的比較。第五章則使用恆溫環狀擴增法增幅後之結核桿菌產物進行實驗，並細分為免疫反應以及石墨烯氧化物直接檢測。第六章為結論與石墨烯氧化物薄膜之未來展望。. 3.

(20) 第二章基本原理與文獻回顧 2.1 表面電漿子共振原理 1902年時，Wood [1]首先發現當電磁波射入刻有光柵(grating)的金屬表面時，其反射光譜將會產生異常現象，此現象被解釋為與沿著金屬表面傳播的電磁共振波有著密切的關聯，即後來所著稱的金屬表面電漿現象。到了1909年，Sommerfeld [2]利用馬克斯威爾方程式(Maxwell’s equations)導出表面電漿波(Surface plasma wave, SPW)的理論。到了1970年左右， Otto [3] 以及Kretschmann [4]分別提出了全反射 (Attenuated total reflection, ATR)的稜鏡耦合結構。由表面電漿波衍生的表面電漿子共振(Surface Plasmon Resonance, SPR)感測器，具有免標記、可進行即時檢測、對光學特性變化靈敏性高的優點，因此目前主要應用於微細結構、生物、醫學、環境的各種參數檢測。. 本論文係利用表面電漿子共振(Surface plasmon resonance, SPR)技術進行生物分子之檢測。對於表面電漿子共振術的了解必須從表面電漿波與表面電漿子共振的產生來著手，本章節利用電磁學的波導原理解出表面電漿子共振之方程式，並了解介電質之改變對表面電漿子共振角所造成的影響，進一步來研究生物分子與表面改質後之感測薄膜的鍵結特性。. 2.1.1 表面電漿波表面電漿波(Surface plasmon wave, SPW)是一種表面電漿集體震盪所造成的波傳導現象。由於金屬是一種內部充滿自由電子的導體，當這些電子受到外加變化電場的作用而產生集體振動，沿著金屬層與介電層界面之間以波的形式傳播，稱為電荷密度波，也就是表面電漿波。當入射角以大 4.

(21) 於臨界角(critical angle)的角度入射稜鏡達到金屬表面，會發生全反射(ATR) 現象，但並非全部能量都會反射，因為在垂直稜鏡-生物晶片介面仍有縱向的殘餘電場存在，這些殘餘電場的傳播常數在垂直稜鏡-生物晶片介面的方向上是虛數，故其強度呈指數衰減，稱為漸逝波(evanescent wave)。需注意的是，表面電漿波僅能透過 TM(transverse magnetic)偏振激發，亦即只能透過光學上之 P 極化波激發，且為非輻射(nonradiative)波[5]。. 圖2.1、在. 與. 空間，介面上表面電漿波(SPW) 被激發的情形. 由圖2.1，假設空間被z = 0平面分為兩個半無窮空間，z > 0為介電係數之金屬，z < 0為介電係數之介質。表面電漿波的入射光束為TM wave，所激發的表面電漿波會沿著金屬層. 與介電質之界面傳播，經過移項整. 理後，其金屬/電介質介面的表面電漿波波向量 √ 其中. 為真空中之波向量、. √. 可被表示成： √. 為金屬層之介電常數、為待測物介電層之. 介電常數、為入射波的角頻率，為光速、為入射光波之波長。. 2.1.2 表面電漿子共振 5.

(22) 當一道TM偏振光依序入射空氣-稜鏡-金屬層介面，在稜鏡與-金屬層介面產生漸逝波(evanescent wave)，在介電質層與金屬層介面會激發表面電漿波，圖2.2為表面電漿的色散曲線圖(dispersion relation)，. 是波向量，ω. 是頻率，是真空中的光速，為耦合介質的折射係數，圖中斜率為. 的. 直線是真空中光波的色散曲線，使用稜鏡耦合介質可改變其斜率，進而成為圖中另一條斜率為量。圖2.2中斜率. 的直線，而SP wave為表面電漿波的水平波向的直線和表面電漿波之水平波向量的線兩線交點. 處，即為表面電漿子共振發生之處[6]。. 圖2.2、表面電漿之色散曲線圖. 當光波入射稜鏡後，在金屬介面傳播的水平波向量. 其中. ，可表示為下式：. 為真空中之波向量、為入射光所在物質的折射率(從入射光所穿透. 物質的折射率順序為. →. →. ) 、為入射角度、為入射波的角頻率，. 為光速、為入射光波之波長。 6.

(23) 由式(2-1)與式(2-2)以及圖2.2，當入射光波平行於界面之波向量分量 (. )等於表面電漿波之波向量(. )時，會產生表面電漿子共振現象。因此. 表面電漿子共振的條件為. ，即 √. 2.1.3 表面電漿子共振之激發表面電漿波的動能相當高，為使光波激發表面電漿波達到表面電漿子共振模態，光波在介質中傳遞的動能通常需要藉由外部的媒介來提升動能。可達成此目的方法主要有稜鏡耦合式(prism couplers)、光波導耦合式 (waveguide couplers)以及光柵耦合式(grating couplers)等方式，而在本論文中，我們選用稜鏡耦合之方式來激發表面電漿波。. 稜鏡耦合的方式如圖2.3所示，主要有兩種組態：(1) Otto組態[3]，將稜鏡與金屬層保持約102 ~ 103Å 之空氣間隙，當入射光發生全反射時，進入空氣層的衰逝波便會在極靠近稜鏡的空氣與金屬介面之間激發表面電漿波，此架構之缺點是不易掌控空氣層之厚度；(2) Kretshmann組態[4]，直接將金屬薄膜鍍於稜鏡上，因現今鍍膜技術的進步，因此我們可以製作出品質優、厚度佳的金屬薄膜，再加上Kretshmann組態具有可直接與檢測環境接觸之優點，所以目前多以此種組態為主。. 7.

(24) 圖2.3、稜鏡耦合式表面電漿子共振架構：(a) Otto 架構，在稜鏡與金屬之間有一厚度極小之空氣層；(b) Kretschmann 架構，直接將金屬鍍於稜鏡上. 2.1.4 表面電漿子共振之光學感測表面電漿子共振技術為一種利用折射率的變化來檢測金屬層上的待測物之交互作用的技術。由式(2-1)與式(2-2)，我們可得到表面電漿子共振的條件為. ，因此有許多方法來促使表面電子漿共振，依不同調變方. 式可分為下列四種類型：角度調變、波長調變、強度調變以及相位調變 [7-8]。. 角度調變(Angular modulation) 單一波長的光以不同的入射角度入射待測物，其反射光對應產生之光強變化，會在滿足與表面電漿波動耦合情況下產生一極小值，此角度稱為共振角. 。藉由此種調變方式測量不同角度的反射光強，得到共振角改變. 量後可以反推介面上折射率的改變，或是金屬膜上吸附的分子量多寡. 波長調變 (Wavelength modulation) 變換不同的入射光波長在固定角度入射待測物，所獲得之反射光強對 8.

(25) 光波長之頻譜圖中，會在滿足表面電漿波動耦合情況下產生一極小值，此時的波長稱為耦合波長，因此可藉由波長的調變得到一最小反射光強，此即為表面電漿子共振之波長。由於表面電漿波的傳播常數以及稜鏡、金屬膜、待測物質等介電常數皆為波長的函數，因此當待測物折射率改變時，欲激發表面電漿波的波長亦會同時改變。. 強度調變 (Intensity modulation) 表面電漿子共振技術最直接的量測方法，是在固定入射光波長與固定入射角的情形下，量測其反射光的強度變化。也就是共振角波長對待測物的折射率. 或者是共振. 改變而變化的曲線中，選擇接近耦合角或耦. 合波長處的陡降或陡升曲線範圍，固定入射光波長與固定入射角，則量測到的反射光光強變化與. 變化接近線性。. 相位調變 (phase modulation) 利用Fresnel表面電漿子共振模型(Fresnel SPR models) 可以預測待測樣本之折射率. 改變時，反射光的劇烈相位變化。以Michelson或. Machzender干涉儀之光學架構，可以獲得反射之TM 偏振波的相位變化。. 上述四種方式中，角度調變、波長調變以及相位調變應用最為廣泛，其折射率量測解析度優劣比較可參見表2.1，在計算解析度時，除了要考慮量測之角度、波長、相位對折射率變化之曲線斜率外，還需要考慮整體實驗架構的儀器量測角度(degree)、波長(nm) 與相位之解析度，才能計算出最後折射率(refractive index, RI) 之解析度。表2.1中角度和波長調變方法獲得之光強度的折射率解析度大致相同，分別為1.5×10-6和1.8×10-6；相位調變方法的解析度則是0.5×10-6，解析度較高，大約為另外兩種方法的3倍。 9.

(26) 但由於此法動態量測範圍(dynamic range) 不大，在折射率變動範圍較大的實驗情況較不適用。所以，如果在偵測範圍為未知的條件下，可先以角度調變或波長調變方法進行大範圍折射率變動偵測，待粗略的折射率解得後，再輔以相位調變之方法求得更高解析度之折射率，應是一個有可能兼顧量測範圍與精準度的選擇。. 表2.1、不同調變方式之解析度比較 [7-9] 調變方式角度調變波長調變相位調變. 斜率. 儀器解析度. -4. -2. 1.5×10 RI/deg 1.8×10-4 RI/nm 2.0×10-5 RI/deg. 1×10 deg 0.01 nm. 2.5×10-2 deg. 折射率解析度. 1.5×10-6 RI 1.8×10-6 RI 0.5×10-6 RI. 2.1.5 表面電漿子共振生物感測器表面電漿子共振生物感測器是利用表面電漿子共振技術來即時檢測生物分子與感測層表面之交互作用的一種檢測方式。由於表面電漿波(SPW) 在垂直稜鏡以及生物晶片之介面上呈現指數衰減(exponential decay)，所以只有在與緊鄰分子自組裝單層膜(Self-assembled monolayer, SAM) 附近產生鍵結反應才會被系統偵測到，而且感測晶片上的SAM 薄膜經過不同的活化處理後，固定上不同抗原，便可以與不同種類的抗體結合，亦可檢測酵素、胞器或核酸等物質。原理主要是利用來自生物體本身具備的高特異性及高靈敏度，來接受分析物的選擇而產生專一性的反應。. 為了產生表面電漿子共振，我們必需在稜鏡表面鍍一層金屬薄膜，此薄膜厚度與所使用之入射波長以及稜鏡材質的光學常數有關。但透過稜鏡耦合激發表面電漿子共振的成本極高，因此我們使用與稜鏡折射係數相同的蓋玻片並將金屬層鍍於其上，接著透過耦合油將鍍上金屬層的蓋玻片與 10.

(27) 稜鏡表面耦合，使兩者折射係數相同，進而激發表面電漿子共振，此種取代方法可大量地節省實驗成本。金屬層的厚度為一重要參數，如果金屬薄膜太厚會讓從稜鏡入射之光波無法在待測之生物分子薄膜與金屬薄膜介面產生表面電漿波，或者產生表面電漿波之效率降低；如果金屬薄膜太薄則會導致產生表面電漿子共振現象之轉換速率變非常快，將無法偵測出其微量變化。因此，欲鍍金屬薄膜之厚度必需在產生表面電漿子共振效能與靈敏度之間須取得平衡。常見的金屬薄膜材料為金(Au)與銀(Ag)，雖然說使用銀作為金屬薄膜之SPR感測器靈敏度較高，但由於銀的表面穩定性差，容易氧化，且不利於生物檢測之表面再生步驟(regeneration)，因此在本論文，我們使用黃金作為SPR感測器之金屬薄膜，使用之膜厚約為50 nm [5, 10]。. 2.2 表面電漿子共振金膜之固定化本節主要討論表面電漿子共振金膜的固定化，討論各種表面修飾的技術及方法，以利於接下來與生物分子交互作用的檢測。各種方法的設計，都依循著“非特異性結合率越低越好”的原則，這主要是為了避免不相關的雜訊干擾進而影響感測結果。由於SPR技術可以廣泛地對不同種類的分析物進行檢測，因此也發展出許多分子固定化的方法，但由於分子間的特性差異非常大，因此並沒有通用的固定化方法。本節首先介紹金屬表面修飾的方法，本論文中皆使用分子自組裝單層膜(Self-assemble monolayer, SAM)技術來修飾欲測薄膜的表面；接著再介紹生物分子的固定化方式。. 2.2.1 金膜之表面修飾從前 SPR 技術應用在生物分析時，蛋白質是以簡單的物理性吸附在活化過後的金屬表面[11]。然而，人們很快地體會到，我們需要發展更精密 11.

(28) 的方法來挑戰更大範圍的蛋白質應用層面。常用的金屬基板像是金和銀，表現出高自發性地吸附蛋白質或其他分子，但這些分子被動的與基板結合後，會對生物分子的活性造成影響。1917 年時，Langmuir [12]透過油脂可輕易散佈於水面上之特性，研究出這樣的油脂層可以薄到僅一個分子層的厚度，他也是第一位利用單層膜 (monolayer)具有規則排列與方向特殊性質，製備出排列整齊並且具有方向性分子薄膜的科學家。. 分子自組裝單層膜 (Self-assemble monolayer, SAM) 為了減少非特異性的吸附，以及引進特異性固定化之反應基團，在固定化之前，需要有一層物質覆蓋於金屬表面，目前已研究出許多不同的方法。其中最成功的例子為使用硫醇或二氧化硫分子透過自我組裝技術鍵結於金屬表面上。自我組裝單層膜的發展起源於1946年Bigelow等人[13]發現長鏈狀的胺類分子可以自我吸附在乾淨的鉑金屬表面上，形成一層單分子層；而有機二硫化物(disulfide)會自發性的在吸附在金膜表面形成單層膜這個現象，最早則在1983年由Nuzzo等人[14]在界面模型的研究中提出。幾年後，矽烷化合物可吸附在SiO2、Al2O3 上，硫醇化合物可吸附在金、銀、銅上之相關理論也於幾年後陸續被提出。圖2.4為SAM技術的示意圖，主要是有機分子藉由特定官能基以物理或化學的方法吸附在基板的表面上所形成的薄膜，近年來此技術已被廣泛地運用在基礎理論的分析與研究上。. 12.

(29) 圖2.4、分子自組裝單層膜(SAM) 技術之示意圖. 如圖2.5 所示，分子自組裝單層膜的結構可以分為三個部分[15]：第一部分為分子的頭基(head group)，通常是具有表面活性(surface-active)的物種，用於將分子吸附在表面上，最常見的是有機硫醇吸附在金的表面[16]以及羧酸吸附金屬氧化物上。當這些具有表面活性的物種與基板進行自發性的化學吸附時，會產生放熱反應，每莫耳分子吸附時所放出的能量可達數千焦耳。第二個部份為橋基(spacer)，此部份多半是使用直鏈的烷類，在吸附時，烷鏈與烷鏈間會因分子間堆疊的凡得瓦力(van der Waals interactive forces)，使基板表面上的整串分子與分子之間保持固定的距離，有助於形成緊密且有規律性的排列結構。第三部分為末端官能基團(terminal group)，為最遠離基板表面的部分。由於分子吸附到基板上後，基板表面也完全被此末端官能基所覆蓋，因此在形成單層膜後，此官能基的特性就決定了自我組裝單層膜的性質。它可以是簡單的甲基，或是具有親水基團[16]、疏水基團[16]、氧化還原中心等的官能基。. 13.

(30) 圖2.5、分子吸附在基板表面的SAM薄膜結構圖. 以硫醇化合物吸附在金屬的例子來說，分子自組裝單層膜的形成，是由硫和金屬間強烈的作用力，伴隨著烷基鏈(alkyl chains)之間的凡得瓦力所驅使。因為有足夠的鏈長，最後在金屬表面形成的單分子層是密度高、方向一致且結構非常的穩定。這種奈米尺度的薄膜層，以現今的技術，已經可輕易的透過市售物質來製作。 80 年代末由 Biacore 公司開發的儀器，是最早將分子自組裝單層膜(SAM)技術應用於生物感測器的公司[17]。. 硫醇在金膜表面上之分子自組裝單層膜即使分子自組裝單層膜技術已廣泛被研究，但使用烷基硫醇自組於黃金表面的單層膜，依然是SAM技術中最受矚目的，而本論文主要也使用硫醇在金膜表面上形成分子自組裝單層膜。硫醇吸附於金膜之系統有三項特點：(1)金為反應性較鈍的金屬，在大氣中不易被氧化，有助於硫醇化合物的吸附；(2)硫醇的官能基與黃金之間有強烈的作用力，硫與金的鍵能約為 45 KJ/mol，此作用力較其他官能基與金之作用力來的強大[18]；(3)隨著烷基硫醇分子碳鏈數增加，分子排列將會越有規則性[19]。. 2.2.2 分子固定化技術隨著SPR技術的進步，也促使了許多針對不同物質的固定化方式的發 14.

(31) 展，這些物質除了蛋白質，也包含DNA、RNA、醣類結構，以及各種有機分子，像是脂類或其他更複雜的自然產物。固定化的方法，從早期的吸附，到現在利用化學共價鍵和不同種類的專一性，已成功且廣泛的發展。如圖 2.6所示，本論文將簡單介紹最普遍的分子固定化技術，包括共價鍵結以及非共價鍵結的捕捉技術。. 圖2.6、不同的固定化方法及欲測薄膜表面分子鍵結示意圖. 共價鍵結法 (covalent Immobilization) 由於簡單的分子吸附過程並不穩定，為了控制分子固定化的過程，有許多表面修飾技術的方法已被提出。透過不同種類的官能基被固定到基板表面後，使得官能基與官能基之間可以穩定地互相鍵結，此方法即為共價鍵結。此技術更可透過表面活化步驟來提升基板與生物分子間的鍵結力。常見的有直接共價鍵結法與間接共價鍵結法。. 直接共價鍵結法為利用表面修飾後的羧基 (carboxylic acid groups, -COOH)與生物分子的胺基(amino groups, -NH2)直接鍵結來檢測生物分子。雖然將胺基與活化的羧基群耦合是組成共價鍵結最常見的方法，但在某些特定情況下，如分子可能缺乏胺基群等情況，我們需要其他更合適的替代 15.

(32) 方法[20]。常見的間接共價鍵結法如醛基耦合法等。而本論文係使用直接共價鍵結法來執行實驗，並透過傳統金膜與石墨烯氧化物修飾後之薄膜比較靈敏度的差異。使用此種方法可有效地節省實驗成本與時間，因此將會著重於羧基與胺基的直接共價鍵結來介紹。. 將黃金薄膜表面耦合成羧基，是共價鍵結中最廣泛使用的方法。而最常使用的親核試劑是賴氨酸殘基(lysine residues)中的氨基群，而羥基 (hydroxyl groups)也被廣泛地使用。. 圖 2.7、透過 EDC/NHS 活化羧基群之流程示意圖. 如圖2.7，我們常以碳二亞胺(carbodiimide)試劑將表面活化來促使羧基與胺基之間的醯胺鍵(amide bond)的組成，或是羧基與羥基之間的酯鍵 (ester bond)的組成。最普遍使用的活化劑為可溶於水的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC) [21]。使用碳二亞胺的目的在於其可產生具活性的O-acylisourea group，作為中間介質與羧酸基作用，接著與合適的親核試劑反應。然而在水溶液中，這個中間介質O-acylisourea的活性非常高，若是沒有被其他競爭的親核試劑捕捉的話，會快速水解又轉變回羧酸。這個副作用可以輕易地被碳二亞胺與活性羥基化物的混合物所克服，所形成的活性酯衍生物可以穩定幾分鐘至幾小時。. 16.

(33) 而N-羥基丁二醯亞胺(NHS)非常適合應用在活化過程中，NHS通常在高濃度下與EDC溶解於水中。EDC與NHS扮演一個緩衝試劑的角色，其酸鹼值約在pH 6左右，在這個條件下，NHS能達到酯化反應的最佳速率。雖然還有其他像是硝基苯酚(nitrophenol)的化合物也能夠進行酯化反應，但由於NHS在水中的溶解度佳、相對毒性低、且能夠在兩個步驟內完成耦合，所以是最常被使用的活化劑。. 非共價捕捉法 (non-covalent capture) 前面所敘述的共價鍵結方式，在某些情況下會有所限制。例如，分子在低於所需的耦合條件下會不穩定，或是鍵結的活性會降低；如果分子是出現在細胞裂解液或其他複雜的物質中的小量樣品，其他問題也可能浮現。在這種情況下，選擇非共價捕捉(non-covalent capture)的固定化方法較佳。非共價捕捉法的原理，是基於感測器表面的試劑與待測物之間的親和性鍵結，或是在待測物加上能夠被辨別、捕捉的標記。此方法的優點為在分析之後可以除去固定化結合的配對，經由表面再生的步驟，在下一個測試的循環重複使用；與共價耦合的方法相比，缺點為樣品的大量消耗。. 最常使用的試劑是具特異性的抗體，對應於特殊的蛋白質，或是標記的蛋白質，也就是所謂的免疫反應。常用的標記包含GST，FLAG及poly-His residues。除了抗體外，也有可能是由其他分子組成。像是His標記的蛋白質就可以被氨三乙酸(nitrilotriacetic acid, NTA)和鎳離子金屬螯化物所捕捉。這樣的鍵結可以輕易地藉由像是氫氧化鈉(NaOH)或者鹽酸(HCl)等酸鹼試劑所破壞，感測器表面經過活化之後又可重複使用。. 17.

(34) 2.3 石墨烯衍生物與生物感測器上之應用石墨烯(graphene)是由碳原子以 sp2 混成軌域呈蜂巢晶格排列構成的單層二維晶體，其厚度約為一個碳原子厚度[22]。2004 年時，英國曼徹斯特大學的安德烈·海姆(Andre Geim)以及康斯坦丁·諾沃肖洛夫(Konstantin Novoselov)成功地透過膠帶剝離的方法將石墨分離出單層的石墨烯，師徒兩人也於 2010 年共同獲得諾貝爾物理學獎的殊榮[23]。. 石墨烯目前已有三種衍生物，分別為石墨烯(Graphene)、石墨烯氧化物 (Graphene Oxide, GO)以及還原石墨烯氧化物(reduced Graphene Oxide, rGO)。目前已有多篇將石墨烯衍生物應用於生物檢測上之文獻，本人將其細分為：(1)以石墨烯為基礎之電化學生物感測器；(2)以石墨烯為基礎之表面電漿子共振生物感測器；(3)以石墨烯氧化物為基礎之螢光生物感測器以及(4)以還原石墨烯氧化物為基礎之場效電晶體生物感測器來分別討論。本篇論文在此提出(5)以石墨烯氧化物為基礎之表面電漿子共振生物感測器，並與上述四種生物感測器進行比較。. 2.3.1 石墨烯(Graphene) 石墨烯可想像為由碳原子和其共價鍵所形成的原子尺寸網，被認為是平面多環芳香烴原子晶體。由於石墨烯(Graphene)的高導電性與大表面與體積比，石墨烯目前已經應用於光電元件、化學感測器、生物感測器與奈米複合材料等相關應用上[24]。. 以石墨烯為基礎之電化學生物感測器 2010 年，Lv 等人[25]使用非共價鍵的 π-π 堆疊法將石墨烯與 DNA 雜合，並應用於玻璃碳電極上，稱為 GN/DNA-GC 電極，並針對 GN/DNA-GC 18.

(35) 電極與傳統的玻璃碳電極的實驗結果相互比較。實驗結果顯示， GN/DNA-GC 電極有更大的氧化還原電流與更佳的可逆性，其氧化還原峰的電流約為傳統玻璃碳電極的 5 倍。使用 GN/DNA-GC 電極執行循環伏安法的結果顯示一個幾乎對稱的氧化還原峰，這表示 GN/DNA-GC 電極上的電子轉移率有著明顯的增強效果。因此，藉由石墨烯之大表面積檢測範圍以及高靈敏度，GN/DNA-GC 電極具有更佳的檢測性。. 以石墨烯為基礎之表面電漿子共振生物感測器 2010 年，Wu 等人[26]針對石墨烯表面電漿子共振技術進行模擬，該感測器採用衰減全反射(Attenuated total reflectance, ATR)的方式來觀察感測器表面生物分子之吸附所造成的折射率變化[27]。實驗數據與模擬結果一致，單層石墨烯的穿透率約為 97.7%，代表一個原子厚的石墨烯層，將會吸收 2.3%的入射光[28]。透過模擬數據也發現，每增加一層石墨烯層，其穿透率會減少 2.3%。藉由模擬結果與實測光譜的一致性，Wu 等人開始對石墨烯表面電漿子共振感測器進行光學行為之模擬。模擬結果顯示，石墨烯薄膜 SPR 生物感測器之靈敏度優於傳統的黃金薄膜 SPR 生物感測器。其靈敏度的增加是由於石墨烯吸附生物分子的增加以及石墨烯本身之光學性質所致，因此石墨烯 SPR 生物感測器靈敏度的提升與石墨烯之層數呈線性關係，其靈敏度最高可提升 25%。. 2011 年 Choi 等人[29]使用銀作為基板進行 SPR 模擬，雖然銀的靈敏度與效能皆優於以金，但銀容易氧化，造成銀基板無法進行表面再生 (regeneration)步驟，因此以銀為基板之 SPR 系統並不適合進行生物研究。. 2012 年，Salihoglu 等人[30]成功地將石墨烯透過化學氣相沉積法 19.

(36) (Chemical Vapor Deposition, CVD)塗佈於銅箔上[31]，並轉印至金膜與銀膜表面，轉印後使用表面電漿子共振技術透過微流道系統研究石墨烯薄膜和蛋白質之物理性交互作用。Salihoglu 等人將 SPR 角度固定在 49 度進行微流道系統之即時檢測，透過不同濃度的牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)與石墨烯薄膜表面進行靜電吸附作用，微流道實驗過程約為一個半小時，其曲線斜率記為結合常數(Ka)，約為 2.4×10-5 M-1 s-1。Salihoglu 等人預估石墨烯表面電漿子共振感測器可用來分析有機溶劑之吸附，進而廣泛應用於環境維護與製藥工業上。. 2.3.2 石墨烯氧化物(Graphene Oxide, GO) 石墨烯透過氧化及化學處理，使其漂浮在水中，透過此步驟，石墨烯會剝落並形成有強力鍵的單層，其表面會被官能化，稱為石墨烯氧化物 (Graphene Oxide, GO) [32]。由於石墨烯氧化物具有易修飾的化學特性、在水中的高分散性、大量的表面官能基等特性，因此石墨烯氧化物的應用範圍相當廣泛。除了生物感測器的分子檢測與細胞成像應用之外[33-34]，亦可有效地提升太陽電池效率，應用於太空電梯與纜線上，也可進行單分子氣體偵測，或應用於透明導電電極上，作為超級電容器的材料等。. 石墨烯氧化物(GO)的化學結構如圖2.8所示，其結構仍維持石墨烯的六角形晶格結構，而石墨烯氧化物的表面缺陷以及邊界處，皆含有大量的含氧官能基團。藉由Lucas等人[35]的分析結果顯示，環氧基(epoxy, C=O)、羥基(hydroxyl, C-OH)、羧基(carboxyl, -COOH)以及羰基(carbonyl, C-O)皆分佈於石墨烯氧化物之表面缺陷處以及其邊界處。石墨烯氧化物最大的優點為其大量的表面官能基，經過活化作用後，可與生物分子緊密地鍵結，形成強力的共價鍵。 20.

(37) 圖2.8、(a)石墨烯、(b)石墨烯氧化物之表面形態. 目前有許多方法可以證明石墨烯氧化物(GO)的表面及邊緣存在著 -COOH 、 -OH 以及 C=O 鍵等環氧官能基群，如紅外光光譜儀 (infrared spectroscopic, IR)、核磁共振光譜儀(nuclear magnetic resonance, NMR)以及電子繞射技術(electron diffraction)等。由於GO的表面與邊緣具有大量的羧基(-COOH)以及羥基(-OH)，因此，我們藉由此特性將GO視為介質，並與後續生物分子如蛋白質、DNA等進行共價鍵結[36-37]。. 以石墨烯氧化物為基礎之螢光生物感測器 1994 年 Kagan 等人 [38]提出螢光染料分子吸附在石墨塊上會導致淬熄的結果，然而，石墨烯氧化物(GO)與還原氧化石墨烯(reduced Graphene Oxide, rGO) 之 SP2 結構也會以類似的方式將螢光物質淬熄，如螢光染料以及共軛聚合物[39-40]。雖然 GO 和 rGO 的淬熄效率之定量分析還有待據悉，目前的研究結果顯示，GO 的淬滅效率是天然石墨的 103 倍大。此淬熄效應來自於熒光物種和 GO 或 rGO 之螢光光共振能量轉移，或非輻射的偶極偶極耦合所造成。. 2010 年，Liu 等人[36]使用石墨烯氧化物之特性來探討石墨烯與 DNA 之雜合情形。當 DNA 探針與 GO 表面透過碳二亞胺(carbodiimide)化學雜 21.

(38) 合法與黃金奈米粒子標記的 DNA 鏈互補時，GO 陣列的熒光強度將會急劇減少。此方法將導致黃金奈米粒子和 GO 薄膜之間的能量傳遞約有 87%的熒光淬熄。此種大量的淬熄行為可歸因於螢光染劑和 GO 表面之間的長程電子能量傳遞所造成。. 在離子基團與芳香基族群的存在下，石墨烯氧化物(GO)可以以多種方式與生物分子交互作用。存在 GO 平面跟邊緣的離子基團，使得帶電荷的蛋白質與去氧核糖核酸(DNA)可以產生靜電力鍵結[40]，而芳香基族群對 GO 提供了一個 π-π 堆疊的平台並同時對染料淬熄。石墨烯氧化物表面之羧酸基團也可被視為一個酸性樹脂，允許與帶電荷的分子交互作用，以形成分子複合物。這些交互作用指出，生物分子的鍵結強度可由 GO 來調整，提供了蛋白質研究之選擇的可能性。目前螢光淬滅的特性已被應用於石墨烯氧化物光學感測器，用來檢測 DNA 和生物分子的交互作用[41]。. 由上述實驗結果可知，我們可將石墨烯氧化物(GO)視為一個快速、高靈敏度且具高選擇性的感測測層來檢測生物分子。由於石墨烯氧化物的低成本與大表面積等特性，使得石墨烯氧化物生物感測器相當有應用空間。. 2.3.3 還原石墨烯氧化物(reduced Graphene Oxide, rGO) 由於單層石墨烯(Graphene)的導電率取決於碳平面上載子的傳遞，而氧化石墨烯(GO)的表面具有許多的含氧官能基，這些官能基對導電率會是個很大的影響。而從圖 2.8 中可觀察到，平面上都是 -OH 與環氧基，邊緣是 -COOH 與 C=O，由於-COOH 與 C=O 存在於邊緣或是缺陷的地方，因此對導電率的影響較小，因此 GO 要提升導電率，主要的目標就是去除 -OH 與環氧基。 22.

(39) 目前文獻記載的石墨烯氧化物還原技術有電化學還原、熱退火還原、微波光照還原、化學還原與光觸媒還原等方法。表 2.2 針對電化學還原與熱退火還原之優缺點進行比較。表 2.3 為調控 GO 還原程度的難易比較。. 表 2.2、電化學還原與熱退火還原法優缺點比較還原方式電化學. 熱退火. 優點缺點簡單快速、非破壞性、還原面積小，受限於電化學系不產生副產物統的反應槽體積易產生缺陷、需要高溫設備、還原程度最好耗能及需要許多的關鍵條件，聚合物與非耐高溫材料不適用. 表 2.3、調控 GO 還原程度的比較表還原方式電化學熱退火化學. 可調控程度較易中較易. 調控方式由掃描速率與掃描圈數控制由溫度、退火時間控制由還原劑濃度、還原時間控制. 以還原氧化石墨烯為基礎之場效電晶體生物感測器由於石墨烯的高電子遷移率以及大表面積的特性，使得石墨烯 FET 生物感測器的表現優於傳統的奈米碳管 FET 生物感測器。2011 年，Myung 等人[42]將還原的石墨烯氧化物(rGO)封裝於奈米粒子 FET 生物感測器，並對於乳腺癌的主要標誌物，Human Epidermal growth factor Receptor 2 (HER2)以及 epidermal growth factor receptor (EGFR) [43]蛋白進行高靈敏度檢測。實驗結果顯示，此 rGO 奈米粒子 FET 感測器只會針對 HER2 以及 EGFR 進行選擇性之交互作用[44]，可由相對電導率的改變來觀察。該感測器之靈敏度相當高，HER2 檢測極限可達 1 pM，而 EGFR 則為 100 pM。而 HER2 跟 EGFR 檢測極限的不同是因為這兩個蛋白對單株抗體之親和力 23.

(40) 的不同所導致。此生物感測器有高靈敏度以及選擇性能力來檢測不同的生物樣品。由於石墨烯-奈米粒子之 FET 生物感測器之生物相容性，並具有良好的電化學和的電性能，使得石墨烯 FET 生物感測器未來在臨床應用上相當有發展性。. 2.3.4 以石墨烯氧化物為基礎之表面電漿子共振生物感測器以石墨烯氧化物為基礎之表面電漿子共振生物感測器本論文提出石墨烯氧化物薄膜於表面電漿子共振生物感測器之研發，係ㄧ種以石墨烯氧化物為感測層之表面電漿子共振生物感測器。將石墨烯氧化物(GO)透過化學修飾固定在金膜表面，並透過表面電漿子共振技術進行檢測。此技術利用表面電漿子共振免標記、即時檢測之特性，並加上石墨烯氧化物表面大量的含氧官能基，有利於與生物分子共價鍵結等特性，為一項相當有發展前景之生醫檢測技術。而表 2.4 也針對目前石墨烯相關的生物感測器進行優缺點比較。. 目前國內外尚未有實驗室提出此整合物理、化學以及生物學之跨領域應用，本實驗室將首開先例設計並執行此實驗，因此，本論文之石墨烯氧化物薄膜的研發為一相當具有前瞻性與應用價值之實驗。. 24.

(41) 表 2.4、以石墨烯為材料應用於生物感測器之比較石墨烯相關生物感測器以石墨烯為基礎之電化學生物感測器 Graphene based Electrochemical biosensor. 以石墨烯為基礎之表面電漿子共振生物感測器 Graphene based SPR biosensor. 以石墨烯氧化物為基礎之螢光生物感測器 Graphene Oxide based Fluorescence biosensor. 以還原石墨烯氧化物為基礎之場效電晶體生物感測器 reduced Graphene Oxide based FET biosensor. 以石墨烯氧化物為基礎之表面電漿子共振生物感測器 Graphene Oxide based SPR biosensor. 優點 1. 不需標記螢光染劑。 2. 系統設備簡易。 3. 導電性高。 4. 靈敏度高。. 缺點 1. 無法執行分子動力學分析(kinetic)。 2. 實驗步驟繁瑣，需利用導電高分子進行石墨烯包埋，且薄膜易剝落。 3. 氧化酶酵素易被破壞，造成活性降低。 1. 可進行即時檢測。 1. SPR檢測系統龐大。 2. 不需標記螢光染 2. 無法大量生產。劑。 3. 系統繁雜不易操作。 3. 高靈敏度(fM)。 4. 靜電力吸附，分子穩 4. 分析時間短。定性不佳。 5. 具專一性。 1. 可用於分子成像。 1. 無法執行分子動力 2. 可透過螢光強度來學分析(kinetic)。分辨石墨烯氧化物的 2. 實驗步驟繁瑣，須預尺寸及層數。先將生物樣本標記螢光染劑。 3. 靈敏度差。 4. 螢光放光頻寬過大。 1. 不需標記螢光染 1. 無法執行分子動力劑。學分析(kinetic)。 2. 反應快速。 2. 實驗步驟繁瑣，需還 3. 系統規模較小。原高導電性rGO。 4. 高靈敏度(pM)。 3. 實驗限制需單層石 5. 具專一性。墨烯才能進行，由於單層石墨烯備置困難，因此無法量產。 1. 可進行即時檢測。 1. SPR檢測系統龐大。 2. 不需標記螢光染 2. 無法大量生產。劑。 3. 系統繁雜不易操作。 3. 高靈敏度(fM)。 4. 分析時間短。 5. 具專一性。 6. 可執行分子動力學 25.

(42) 分析(kinetic)。 7. 與生物樣品共價鍵結。. 2.4 肺結核的診斷與恆溫環狀擴增法 2.4.1 肺結核的診斷肺結核為一種由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)所引起的感染性疾病，結核分枝桿菌是一種傳染性極強的細菌。結核分枝桿菌會經由肺結核病患以咳嗽或打噴嚏的方式飛沫傳染，肺結核不僅會感染肺部，也同樣會影響肺以外的器官，若發病會造成組織與器官損壞。一般而言，被結核分枝桿菌感染後大約有 10%的人會發病，成為肺結核的患者，而肺結核的發生率比感染人類免疫缺乏病毒(human immunodeficiency virus, HIV)還要高。其中，男人感染的比率較為女人常見，並且大部分發生於壯年期族群，大約有三分之二的病患年齡介於 15-59 歲。根據最新的統計數據指出，2010 年估計包含新的與經常性之肺結核案例共有八百八十萬件，其中有五百七十萬被診斷出來，而在通報的病例中，有二十九萬的 multidrug-resistant TB (MDR-TB)病例僅有五萬三千人(約 18%)被診斷出來。每年，肺結核大約造成兩百萬人的死亡，且主要發生於發展中國家，而目前在全球的案例中，肺結核的發生率每年約攀升 2%左右。結核分枝桿菌 (mycobacterium tuberculosis complex, MTBC)病毒的感染往往比較難以診斷，因為患者通常不具有明顯的發病症狀，因此在臨床上對於結核桿菌病毒的快速檢驗非常的重要[45-46]。. 2.4.2 恆溫環狀擴增法 2000 年時，Notomi 等人[47]提出了一種新型的核酸擴增法，並將其取 26.

(43) 名為恆溫環狀擴增法(Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP)。其特點為實驗操作簡單，在恆溫環境之下即可進行。擴增過程主要為選定四個引子(Primers)去辨識目標 DNA 的 6 段特定序列，因此產物之專一性較高。傳統的聚合酶連鎖反應(Polymerase chain reaction, PCR)方法需要昂貴的儀器進行熱循環反應，然而 LAMP 技術只需要簡單的恆溫儀器，如水浴槽，並將溫度固定於 60℃左右即可進行實驗。比起傳統 PCR 作用之 107 倍的產物量且需要 2 至 3 小時的作用時間，透過 LAMP 技術放大的產物量可高達 1010 倍，而且作用時間僅需 15 至 60 分鐘，為省時且有效之放大技術。因此，LAMP 技術對於感染性疾病的診斷，是一個非常有效率方法。. 恆溫環狀擴增法(LAMP)主要是藉著內引子(inner primer)及外引子 (outer primer)引導 DNA 聚合酶催化而自動循環合成 DNA。在 LAMP 反應中的特別之處在於引子的設計以及使用 Bst DNA 聚合酶。Bst DNA 聚合酶，來自嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)，這是從一種由細菌所純化生產的酵素，適合生存於 55℃到 65℃的高溫環境，並且可於此高溫環境與引子對進行聚合作用，增幅出具有自我互補能力的 DNA 片段，形成具有圈環的啞鈴型結構，因此在圈環的部分可再與內引子對接合藉此連續且重複反應，進而產生大量的 DNA 片段。由於 Bst DNA 聚合酶缺乏 3’→5’ 的 DNA 分解能力，在 DNA 聚合的過程中，只能將模版 DNA 上既有的互補 DNA 鏈整條鏟起。這種聚合酶最主要的特性是具有非常強的的鏈置換能力(strand displacement)，因此不需加熱就能使 DNA 雙股分離。. 在初始的 LAMP 反應當中，如圖 2.9 所示，四個引子都參與其中，之後只剩下內引子參與反應。內引子對包含前置內引子(forward inner primer, FIP)及後置內引子(backward inner primer, BIP)，兩者分別對應目標序列的 27.

(44) 兩段特定區域。如圖 2.9 所示，F2c 及 B2 為目標 DNA 序列的末端；F2c 及 B2 內側取兩段序列定義為 F1c 及 B1；外側則定義為 F3c 及 B3。FIP 由 F1c 及互補 F2c 的 F2 組成；BIP 包含互補 B1 的 B1c 及 B2；兩個外引子分別是 B3 及 F3c。. 圖2.9、目標(Target) DNA與引子(Primers) 示意圖. LAMP 技術在反應的過程中會有焦磷酸的釋放，與反應液中的鎂離子會形成白色的焦磷酸鎂沉澱，隨著反應時間的增加，用肉眼即可觀察到大量的白色沉澱物。為求效果，尚可加入核酸染劑，如溴化乙錠 (ethidium bromide, EtBr)與 SYBR Green I 等，接著使用 UV 照射來觀察反應結果，效果比直接用肉眼觀察白色沉澱更佳。LAMP 技術發展至今十餘年，該技術已成功被應用於肺結核菌[48]、SARS、禽流感、口蹄疫等疾病的檢測中。在本論文中，我們將使用 LAMP 技術對肺結核桿菌(MTB)進行 DNA 增幅，並藉由不需標定引子且具有高靈敏度的 SPR 檢測技術，對 MTB 進行快速檢測，得到可能發病的 MTB-DNA 樣本濃度。. 2.4.3 肺結核桿菌增幅方法比較 28.

(45) 傳統的結核病診斷方法包括痰液鏡檢(smear microscopy)、核酸增幅診斷以及結核菌培養(mycobacterial culture)等方法。然而，這些診斷技術都各具有一些缺點，因此並不普及。痰液鏡檢操作簡單，但靈敏性不高，而且需要大量的樣品才能進行檢測(105 bacteria/mL) [49]；核酸增幅診斷之費用過於昂貴；而結核分枝桿菌培養，由於分枝桿菌生長緩慢，因此必需六至八周才可得到診斷結果[50-51]，上述缺點導致這些方法在立即診斷與治療上受到限制。目前有許多檢測方法使用核酸放大為基礎的檢測系統，用於直接檢驗臨床檢體中的結核分枝桿菌(MTBC) [52-54]，包括聚合酶連鎖反應(PCR) [55]以及恆溫環狀擴增法(LAMP)等技術[56-59]。然而，傳統的 PCR 擴增的成本高，反應時間長仍然是此方法的主要問題。如表 2.5 所示，我們分別比較痰液鏡檢、PCR 以及 LAMP 技術來放大核酸，比較結果顯示，使用 LAMP 技術來放大核酸，無論在靈敏度或特異性上都優於其他方法，因此，本論文將選擇以 LAMP 技術進行核酸放大。. 表2.5、塗片顯微鏡、PCR以及LAMP之靈敏度與特異性等差異[50] a b 靈敏度(%) 特異性(%) NPV(%) PPV(%) 80 100 85.8 100 Smear 91.6 95.9 93.3 94.8 PCR 100 95.9 100 95.2 LAMP a b NPV (Negative predictive value)為陽性預測值； PPV (Positive predictive value)為陽性預測值. 方法. 29.

(46) 表 2.6、目前已成功透過 LAMP 擴增 MTB 之 DNA 序列[50] 檢測極限靈敏度特異性文獻樣本數目標基因 (複製DNA) (%) (%) 66 gyrB 5-50 Iwamoto et al. [48] 725 gyrB 88.2 99 Boehme et al. [60] 16S 200 10 100 94.2 Pandey et al. [61] rRNA 30 rimM 200 Zhu et al. [62] 10 IS6110 1 Aryan et al. [58] 133 IS6110 1 100 95.9 Kohan et al. [50]. 2.4.4 肺結核桿菌 DNA 序列 IS6110 根據 Kohan 等人[50]所執行的實驗以及整理出之資料，目前已有多種 DNA 序列被研發出來應用於 LAMP 技術來增幅肺結核桿菌 (Mycobacterium tuberculosis, MTB)，分別為：gyrB [48, 60]、16S rRNA [61] 、 rimM [62]以及 IS6110 [50, 58]。如表 2.6 所示，上述之四種 DNA 目標序列中，IS6110 的高靈敏度與高專一性最適合用來增幅 MTB 的 DNA 序列[50]，因此，我們將以 LAMP 技術並選擇 DNA 序列 IS6110 對 MTB 進行擴增。在本論文中，我們預計，透過 LAMP 此技術結合表面電漿子共振之光學檢測將可以大幅提高快速檢測之效率並增加檢測的特異性及靈敏度。. 2.5 分子動力學分析由於生物分子抗原與抗體間的免疫反應並非共價鍵結，而是一種可逆反應，可透過強酸或強鹼將抗原與抗體之結合物解離，因此可透過簡單的可逆方程式加以描述。本節將依此討論速率常數的計算原理，另外也將討論值傳效應等對 SPR 即時檢測之影響。. 2.5.1 分子動力學方程式 30.

(47) 對於簡單的生物分子之可逆交互作用，其鍵結情形之一階方程式可表示如下[63]： A. B ⇌ AB. 4. 在本研究中，主要討論抗體、抗原等分子之動力學參數。當生物分析物與生物晶片上之配體鍵結時，其反應可由下式表示： A. ka. B → AB. 5. 其中，A 為固定在 SPR 生物晶片表面上的配體(ligand)，B 為樣本溶液中的分析物(Analyte)，AB 則是分析物與配體鍵結產生的複合物，而 ka 則是結合速率常數(association rate constant, ka)。. 當生物晶片上的配體與分析物解離時，則可表示為下式： A. kd. B ← AB. 6. 其中，方程式中的 kd 為解離速率常數(dissociation rate constant, kd)。. 由式 (2-5) 與式 (2-6) ，我們可透過 ka/kd 得到結合常數 (Association constant, KA)；亦可透過 kd/ka 得到解離常數(Dissociation constant, KD)。. 由上述方程式我們可得知反應初速率即為鍵結產物對時間的一次微分方程式，對(2-5)式與(2-6)整理後，即可得到時間導數，如下所示[64]： d[AB] dt. k a [A][B]. k d [AB]. 7. 其中，[AB]為生成物 AB 的濃度，[A]、[B]為反應物 A、B 的濃度， d[AB]/dt 為生成物 AB 的濃度時變率，ka 與 kd 分別是結合速率常數與解離速率常數。雖然此式子常使用於化學反應的動力學分析，但由於生物分子間的交互作 31.

(48) 用多半為可逆反應，如抗原與抗體的結合反應等，故此方程式亦可應用於生物分子間的反應。因此後續的訊號分析也將以本節的討論為基礎進行。. 當分析物與配體鍵結時，由於共振條件的改變，將會導致訊號的改變，我們以 R(response)代表分析物固定到欲測金膜表面訊號改變的大小，而 R 的改變與複合物之濃度改變有關，因此以 dR/dt 取代 d[AB]/dt。配體濃度則以(Rmax-R)表示。其中，Rmax 表示當感應晶片上全部配體皆與分析物鍵結時的訊號，為配體鍵結的最大值。由於分析物在與配體鍵結過程中樣本溶液仍持續流動，因此分析物可視為一定值 C。此外，(2-7)式中的 ka 與 kd 則保持不變。於是我們把(2-7)式重新改寫成(2-8)式： dR dt. k a C R max. R. kdR. 8. 𝑘 C. kd R. 9. 我們亦可將式(2-8)移項，得到式(2-9)： dR dt. k a CR max. 其中，R 是表面電漿子共振訊號，dR/dt 是訊號隨時間的變化率，Rmax 為鍵結到 SPR 生物晶片之分析物的最大鍵結量，C 為注入分析物之濃度(M) [65]。. 32.

(49) 圖 2.10、以表面電漿子共振量測生物實驗所得之反應曲線圖. 透過SPR進行即時檢測的量測結果如圖2.10。我們亦可利用dR/dt對時間t作圖，曲線中會有一高原值，即達反應平衡時，R不再隨著時間變化，此時dR/dt = 0，我們令此時之R為Req，則式(2-9)可轉換成為： R eq C. ka (R k d max. R eq ). A R max. A R eq. 此時以Req/C對Req作圖可得一直線，如圖2.11所示，該直線之斜率即為 (-KA)，而該直線在X軸上面的截距所得之Req 即為Rmax。. 圖 2.11、利用 Req/C 對 Req 作圖所得之親和力常數. 若根據式(2-8)與式(2-9)，速率常數 k a C. k d 可透過dR/dt對R作圖而得，. 每一個濃度曲線S 對相對應之配體的濃度C 作圖，可產生一直線，如圖 2.12所示： S＝k a C. kd. 從圖2.12可得知，ka是該直線的斜率，而kd則是該直線在y 軸上的截距。 33.

(50) 圖 2.12、濃度值 S 對反應物的濃度 C 作圖. 由上述文獻結果，我們可得知，反應速率方程式是以時間為變數的一階常微分方程式，因此我們必需使用能偵測不同時間點的濃度變化之檢測儀器才能進行動力學分析。由於表面電漿子共振生物感測器可對生物分子間的鍵結反應進行即時感測，因此非常適合用於進行分子間的動力學分析。. 2.5.2 質傳效應質傳效應(mass transport)是影響反應速率的其中一個因素，它與分子擴散速率、流體流速、流室的形狀及空間大小等有關。擴散速率取決於溶液的黏滯性、待測分子的形狀與大小等因素。擴散速率的快慢會影響流室中配體與分析物的反應速率，這是無法避免的影響，但我們可透過流道的流速與流室的形狀及空間大小來降低質傳效應所造成的影響[66]。. 在考慮質傳的影響之後，(2-5)式及(2-6)式應修正如下[67]： km. A → A 34. ka. B → AB.

(51) km. kd. A ← A. B ← AB. 而質傳效應係數(MTC)可表示為： MTC. 3. √. D2 f . h2 wl. 4. 其中，l、w、h 分別是流室的長寬高(mm)，D 為分析物的擴散係數(m2/s)， f 是體積流率(m3/s)。. 圖2.13、BI-SPR系統建議執行實驗之流速[66]. 圖 2.13 為 BI-SPR 所建議之實驗流速，為了降低質傳效應所造成的影響，將流道系統之流速加快與縮小流室的容量為最直接的方法。但是越大的流速也將導致越多的樣品消耗，增加實驗成本；且幫浦在快速趨動流體的情況下，也可能會導致流速不穩等問題發生。. 35.

(52) 第三章實驗材料、儀器設備與研究方法 3.1 實驗材料 1.. 乙醇 (Ethanol) ： C2H5OH ，分子量 46.07 ，純度 99.9% ， J.T.Baker. ，. #JT-8006-05-4L，USA 。 2.. 丙酮 (Acetone) ： CH3COCH3 ，分子量 58.08 ，純度 99.5% ， ECHO ， #AH3102-4L，Taiwan。. 3.. 異丙醇(Isopropyl alcohol)：CH3CH(OH)CH3，分子量60.10，純度99.9%， J.T.Baker.，#JT-9084-03-4L，USA。. 4.. 胱胺二鹽酸(Cystamine dihydrochloride, Cys)：C4H12N2S2 · 2HCl，分子量225.2，純度>97%，Alfa Aesar，#B22873-25G，USA。. 5.. 石墨烯粉末(Graphene Nanopowder 8 nm flakes)：Grade AO-2，Graphene Supermarket，#SKU-NP-FLAO2-1G，USA。. 6.. 石墨烯氧化物水溶液(Single Layer Graphene Oxide Dispersion in Water)：濃度5 mg/mL，碳79%、氧20%，Graphene Supermarket，# SKU-GO-W-60 mL，USA。. 7.. PBS緩衝液(10X PBS buffer)：UniRegion Bio-Tech，#UR-PBS001-1L， Taiwan。. 8.. EDC [N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride]： C8H17N3 · HCl，分子量191.70，Sigma-Aldrich，#E7750-10G，USA。. 9.. NHS (N-hydroxysuccinimide)：C4H5NO3，分子量115.09，Alfa Aesar， #A10312-25G，USA。. 10. 牛血清白蛋白 (Bovine serum albumin, BSA) ：分子量 66 kDa ， Sigma-Aldrich，#B4287-5G，USA。 11. 牛血清白蛋白多株抗體(Anti-Bovine Albumin antibody, Anti-BSA)：分子量150 kDa，Sigma-Aldrich，#B1520-2 ML，USA。 36.