圓漬點墨法對地高辛精(Dig)之免疫反應檢測

圓漬點墨法(Dot blotting)的原理是將PCR 擴增産物，TB-DNA樣本轉 移到硝酸纖維膜或尼龍膜(PVDF)上，成為一個陣列格式，由於在膜上樣本 呈現點狀，因此將此方法稱為圓漬點墨法。待檢體轉移到硝酸纖維膜或尼 龍膜上後，再與標記的特異性抗體進行免疫反應，接著透過呈色反應來檢 測有無特定的擴增片段及相對含量。此種方法現己廣泛應用於癌基因、病 原體特異基因等方面的研究及檢測。

圓漬點墨法的實驗判讀結果很直接，如果抗原與抗體發生了免疫反應，

在特定點就可以透過呈色步驟看到信號，必要時可以加以定量，但一般都 是陽性或是陰性表示(與相鄰的陽性控制組及陰性控制組的信號比較)。

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實驗程序如下： (參考Roche公司提供之PCR Dig Probe Synthesis Kit) 步驟一：將PCR擴增後的產物(Dig labeled DNA / unlabeled DNA / NO DNA

template) 透過uv-cross link的方式轉移到尼龍膜上，強度單位為 1200 100X μJ/cm2，作用時間為2 min；

步驟二：透過 buffer1 將表面 block (blocking)；

步驟三：在表面滴上 Anti-Dig，使尼龍膜上的 TB-DNA 樣本進行免疫反應 辨認(若有 labeled Dig DNA 即會發生反應)；

步驟四：沖洗尼龍膜表面，將表面未鍵結反應之 Anti-Dig 沖掉；

步驟五：利用呈色劑與表面生物分子作用。(呈色劑會抓抗體 Anti-Dig)；

步驟六： 藉由壓片判讀是否發生免疫反應。在暗房中，使用未曝光之發光 檢測膜壓印至尼龍膜上，並透過發光檢測膜感光，即可獲得檢測 結果。

5.3.5 表面電漿子共振(SPR)微流道系統實驗 5.3.5.1 透過 Digoxigenin 抗體進行免疫分析法

設計不同條件的 TB-DNA 樣本，與 Digoxigenin 抗體進行免疫反應

在此實驗中，我們設計三種條件之TB-DNA樣本進行實驗：分別為Dig labeled DNA(產物含有Dig與DNA)、unlabeled DNA(成分含有DNA，但不含 Dig)，以及NO DNA template(成分含有Dig，但不含DNA，為free Dig)，透 過SPR技術即時檢測Digoxigenin 抗體與TB-DNA樣本之免疫反應。主要目 的是探討SPR技術能否藉由地高辛精抗體(Anti-Dig)準確地偵測TB-DNA樣 本的成分是否含有地高辛精(Dig)。實驗樣本之配置參考Roche公司之PCR Dig Probe Synthesis Kit 所設計，成分及濃度如表5.2所示。

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表5.2、設計三種不同條件之TB-DNA樣本

[本實驗為長庚生技系賴信志教授實驗室所設計之機制]

DIG labeled

DNA unlabeled DNA NO DNA template

10X buffer 5 µl 5 µl 5 µl

10X Dig labeling Mix

(0.35 mM) 5 µl X 5 µl

dNTP (2 mM) X 5 µl X

F2 (1 µM) 5 µl 5 µl 5 µl

B2 (1 µM) 5 µl 5 µl 5 µl

Enzyme Mix (3.5 U/µl ) 0.75 µl 0.75 µl 0.75 µl ddH₂O 24.25 µl 24.25 µl 29.25 µl

LAMP DNA product 5 µl 5 µl X

Total 50 µl 50 µl 50 µl

利用表面電漿子共振技術並透過免疫反應偵測標記Dig之TB-DNA樣本 首先將 Digoxigenin 多株抗體注入表面電漿子共振微流道系統(BI-SPR Instrument, BI-3000G)，使其與修飾後之傳統金膜表面鍵結。接著注入不同 成 分 的 TB-DNA 樣 本 ， 當 核 酸 放 大 後 之 TB-DNA 樣 本 流 經 已 鍵 結 Digoxigenin 抗體之抗體偵測區時，即可辨識被標記 Dig 之核酸。

如圖 5.2 所示，由 LAMP 原本的核酸放大技術，將產物標記上 Dig，

再利用地高辛精(Dig)之抗原-抗體的反應，辨識核酸放大之產物，利用光 源偵測所吸收之偏光角度變化量以判別目標物之存在。(此實驗即利用其原 理並對產物做修飾)。

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圖5.2、透過PCR技術將TB-DNA樣本標記上抗原(Dig)，利用抗原-抗體的免 疫反應經由SPR技術進行快速檢測

如圖 5.2 所示，我們使用 SPR 技術來即時檢測三種不同成分之 TB-DNA 樣本與 Digoxigenin 抗體免疫分析情形。免疫分析法(Immunoassay)，簡單 來說，主要就是偵測某特種異性抗原(來自於結核病菌本身)或是某種特異 性抗體(被感染的生物體自行產生)做為偵測目標，是一種靈敏度與特異性 都很高的檢驗方式。本實驗之生物晶片首先透過自組裝單分子膜(SAM)技 術，將金膜浸入 8-巰基辛酸(8-mercaptooctanoic acid, MOA, 1 mM)溶液中 24 小時，將 MOA 組裝在金膜表面，稱為傳統金膜。待系統校正後，使用 EDC/NHS(0.4M/0.1M)作為活化劑將修飾後之 MOA 金膜表面的官能基活 化，接著在流速為 6 μL/min 的條件下進行實驗。

實驗條件如下所述：

實驗(I) ：傳統金膜 + Digoxigenin 抗體(0.2 mg/ml) + Dig labeled DNA；

實驗(II)：傳統金膜+ Digoxigenin 抗體 (0.2 mg/ml) + unlabeled DNA；

實驗(III)：傳統金膜+ Digoxigenin 抗體 (0.2 mg/ml) + NO DNA template。

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實驗程序如下所述：

步驟一：以去離子水作為實驗溶液，等待 SPR 角穩定；

步驟二：使用 1%酒精進行校正，作為數據間互相比較之基準；

步驟三：注入 EDC(0.4 M)/NHS(0.1 M)將傳統金膜表面之官能基活化；

步驟四：注入濃度為 0.2 mg/ml 的 Digoxigenin 抗體，與金膜表面鍵結；

步驟五：注入不同成分的 TB-DNA 樣本，並觀察不同產物間鍵結之差異。

此外，為了測試恆溫環狀擴增法(LAMP)其增幅時間對透過PCR技術增 幅的TB-DNA樣本之影響，我們在相同增幅成分條件下，將LAMP對DNA 序列-IS6110之增幅時間設定為一小時以及兩小時，並藉由去離子水對PCR 技術增幅之TB-DNA樣本的濃度作調整，最後再透過SPR技術即時檢測免 疫反應之SPR角的差異。主要目的是評估LAMP技術的增幅時間是否跟 Digoxigenin 抗體與TB-DNA樣本鍵結之免疫反應SPR角有關。

5.3.5.2 設計不同 LAMP 產物與 GO 薄膜交互作用

圖 5.3、石墨烯氧化物薄膜檢測 MTB 之流程圖

如圖5.3，本實驗使用石墨烯氧化物薄膜(GO sheets)作為感測層，透過 SPR即時檢測技術直接將肺結核桿菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)以 及陰性對照組(negative control, NC)注入微流道裡，透過表面官能基與石墨 烯氧化物薄膜鍵結。當MTB以及NC流經石墨烯氧化物感測層表面時，MTB

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以及NC會石墨烯氧化物表面直接鍵結，我們將同時檢測兩者SPR角的差異。

將陰性對照組(NC)的實驗結果視為背景反應之變化，即可得到人體中可能 感染肺結核桿菌(MTB)的發病濃度。

下表5.3即為肺結核桿菌(MTB)與陰性對照組(NC)之成分表，使用DNA 序列-IS6110增幅得到之MTB DNA與去離子水(DI water)來區別MTB以及 NC樣本的差異。因此，在SPR實驗中，我們使用的實驗溶液為DI Water，

同時也使用DI Water來對MTB以及NC稀釋。實驗樣本之調配參考EIKEN CHEMICAL公司之DNA Amplification Kit 所設計(Cat. No. 3LP2019B)。

實驗程序如下所述：

步驟一：以去離子水作為實驗溶液，等待 SPR 角穩定；

步驟二：使用 1%酒精進行校正，作為數據間互相比較之基準；

步驟三：注入 EDC(0.4 M)/NHS(0.1 M)將 GO 薄膜表面之官能基活化；

步驟四：注入不同稀釋倍率之肺結核桿菌(MTB)以及陰性對照組(NC)。

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Negative Control (NC)

< 2X Reaction Mix >

Tris-HCl (pH 8.8) 20mM , KCl 10mM, MgSO₄ 8mM,

(NH₄)₂SO₄ 10mM, Tween20 0.1%,

Betaine 0.8M, dNTPs 1.4mM

12.5 μL 12.5 μL

本實驗之流速為 6 µL/min；使用去離子水(DI water)作為實驗溶液；使 用濃度為 1%的酒精作為校正溶液；使用 EDC(0.4 M) 混合 NHS(0.1 M) 作