2.2.1 DNA 萃取
使用Qiagen 公司的藥品，萃取步驟如下：
(1) 將少量肌肉組織加入 300 μl 之 Cell Lysis Solution 中，以燒烤過的解剖剪 刀將組織剪成小碎塊。
(2) 加入 Proteinase K 5 μl，置於恆溫器 55 °C 反應隔夜。
(3) 待組織分解至無塊狀，加入 Protein Precipitation Solution 100 μl，上下輕晃 使溶液混合均勻後作用10 分鐘。
(4) 以 13000 rpm，4 °C 離心 5 分鐘後將蛋白質分離，取上清液至新的 1.5 ml 離心管中。
(5) 加入等同 Cell Lysis Solution 體積的異丙醇 (Isopropanol)，上下輕晃使溶 液混合均勻，置於4 °C 作用 30 分鐘以上促使 DNA 沉澱。
(6) 以 13000 rpm，4 °C 離心 3 分鐘，去除上層液留下底部的 DNA 產物。
(7) 加入 70 %乙醇 500 μl 清洗，作用 10 分鐘。
(8) 以 13000 rpm，4 °C 離心 1 – 3 分鐘，去除所有乙醇並放置於恆溫器上，
以55 °C 加熱 1 個小時以上將剩餘乙醇烘乾。
(9) 加入 30 μl 之 dd H2O 將純化的 DNA 溶解，並以 55 °C 加熱 1 小時以上。
(10) 將所得的 DNA Solution 保存在- 20 °C 冰箱。
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2.2.2 PCR 聚合酶鏈鎖反應
萃取的 DNA 以 PCR 對於 Mitochondrial DNA 中的 cytochrome b (cyt b) 及 cytochrome c oxidase subunit I (COI) 片段增幅以供定序使用 (附錄一)。
(1) 所使用的引子如下:
(a) cyt b (增幅片段長度修正後為 680 bp):
L14725: 5’ -GTG ACT TGA AAA ACC ACC GTT G- 3’
(Song et al., 1998) H15573: 5’ -AAT AGG AAG TAT CAT TCG GGT TTG ATG- 3’
(Taberlet et al., 1992) (b) COI (增幅片段長度修正後為 656 bp):
FishF2: 5’ -TCG ACT AAT CAT AAA GAT ATC GGC AC- 3’
FishR2: 5’ -ACT TCA GGG TGA CCG AAG AAT CAG AA- 3’
(Ward et al., 2005) (2) PCR 反應條件:
PCR 所使用的藥劑為 TaKaRa 的 taq 套裝 kit 組，反應條件如下:
(a) cyt b 的總反應體積 75 μl，內容為 9 μl 之 10 × buffer、6 μl 之 dNTPs、
各6 μl 之 Primer (10 μM)、0.36 μl 之 ex taq 以及 9 μl 之 DNA (50 ng / μl)，
並加入38.64 μl 之 dd H2O 將總體積補至 75 μl。
(b) COI 的總反應體積 50 μl，內容為 6 μl 之 10 × buffer、4 μl 之 dNTPs、
各4 μl 之 Primer (10 μM)、0.25 μl 之 ex taq 以及 6 μl 之 DNA (50 ng / μl)，
並加入25.75 μl 之 dd H2O 將總體積補至 50 μl。
(c) PCR 的反應步驟為:
(i) 94 °C 下反應 5 分鐘使 DNA 雙股分離。
(ii) 接下來為 37 次的增幅循環，94 °C 下之 denature 1 分鐘、
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annealing temperature 47 °C (cyt b) / 50 °C (COI) 45 秒、72 °C 下 之extension 1 分鐘。
(iii) 72 °C 延伸反應作用 10 分鐘，使延伸反應完全。
(iv) 4 °C 暫存，待電泳確認 PCR 產物。
2.2.3 電泳染色
(1) 電泳凝膠製作 (1 %):
(a) 將 0.5 g 之 agarose 加入 50 ml 之 1 × TAE buffer 中。
(b) 使用微波爐加熱 2 分鐘，使 agarose 完全溶解。
(c) 將 2.5 μl 之 HealthviewTM Nucleic Acid Stain 染劑加入並攪拌均勻。
(d) 將液態膠灌入模板中，避光冷卻 40 – 50 分鐘。
(2) Loading sample:
(a) 分別取 5 μl 及 4 μl 之 PCR 產物和 DNA Ladder (100 bp)，各別與約 1 μl 之6 × Loading buffer 混合均勻，並將之填入膠中。
(b) 電泳槽反應條件為，135 V，24 分鐘。
(c) 將電泳凝膠取出放置於照相台上，以紫外光觀察並照相記錄產物。
成功增幅的PCR 產物，其應呈現單一明顯的亮帶。
2.2.4 DNA 純化定序
使用MACHEREY-NAGEL (http://www.mn-net.com/) 之 kit 進行純化，步驟如 下:
(1) 先將 PCR 產物之體積以 dd H2O 補足至 100 μl。
(2) 將 NTI buffer 加入 dd H2O 以體積 1 : 7 的比例稀釋，此步驟的目的是用來 去除非目標產物的小片段產物，使往後的定序能得到更乾淨的序列資
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訊。
(3) 將 100 μl 之 PCR 產物與 200 μl 稀釋過後之 NTI 混合，並移入 Clean – up Column 中。
(4) 以 11000 rpm 離心 1 分鐘，倒掉 collection tube 中的廢液。
(5) 加入 700 μl 之 NT 3 buffer，以 11000 rpm 離心 1 分鐘。
(6) 倒掉 collection tube 中的廢液，重複步驟 (5) 一次。
(7) 倒掉 collection tube 中的廢液後，再以 11000 rpm 離心 2 分鐘。
(8) 將 NE buffer 以每管 30 μl 的體積量先預熱到 70 °C。
(9) 捨棄下層 collection tube，將離心過後的上層 Column 置於新的 1.5 ml eppendorf 上，打開蓋子並置於恆溫器上約 10 – 15 分鐘 (70 °C)，為了將 NT 3 buffer 完全去除。
(10) 每管加入 30 μl 預熱好的 NE buffer，將蓋子緊閉後，繼續放置 70 °C 的恆 溫器上約10 – 15 分鐘，回溶產物。
(11) 以 11000 rpm 離心 2 分鐘，下層 1.5 ml eppendorf 中即為純化好之 PCR 產 物。
純化過後之PCR 產物會以 nanodrop 測量產物濃度，500 – 1000 bp 產物所需的 定序濃度範圍為20 – 50 ng / μl，而吸光值 260 / 280 則是介於 1.8 – 2.0 之間。確認 產物濃度及吸光值在合理範圍內後，將產物與引子分裝並送往國立臺灣大學生物 技術研究中心之核酸定序實驗室進行定序，其所使用的系統為ABI 3730。為了得 到較長及品質較好的序列片段，所有序列皆採雙股定序。