2.3.1 序列整理與物種鑑定
定序完成後的原始序列，先以DNAStar ver. 7.1 中的 SeqMan 及 Editseq 手動將
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雙股序列整理合併並 align，alignment 完成的序列存成 MEGA ver. 6.0 軟體 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0; Tamura et al., 2013) 可讀取之 格式，並以之開啟，因為 cyt b 及 COI 全段皆為蛋白質轉譯基因 (protein - coding gene)，將核苷酸序列轉換為胺基酸序列，觀察是否有終止密碼子出現 (stop codon)，
確保定序的正確性。
為確保所有樣本皆無物種鑑定錯誤的情況發生，從線上基因資料庫NCBI 下載 鯙科內不同亞科及不同屬物種之 COI 序列，將本研究所定序之小鰭鰭尾鯙 COI 序 列加入，並以蛇鰻科物種的序列作為外群，以類聚分析法 (Neighbor – joining, NJ;
Saitou and Nei, 1987) 建構親緣關係樹，所用來計算鹼基替代率與遺傳距離的 model 為 Kimura 之雙參數模式 (Kimura's two-parameter, K2P; Kimura, 1980)，並以 Bootstrap 重複 1000 次計算樹形信賴度之檢測，其數值≧ 85 時代表強的支持度，
介於75 – 85 間代表中等的支持度，所使用的軟體為 MEGA ver. 6.0。除物種鑑定是 使用 COI 外，往後的分析皆以 cyt b 串聯 COI 作為分子標記。
2.3.2 親緣關係之重建
(1) 最大似然樹 (Maximum likelihood tree, ML tree)
Maximum likelihood 法需要三要素來計算: (1) 序列演化之模型 (model of sequence evolution); (2) 具分枝長度的樹狀拓樸 (tree topology with branch lengths); (3) 觀察到序列的性質 (observed character)。將序列排序好後，每一 個位點 (position) 皆視為一個單元，可計算其所有可能變化似然率的總和，便 可得到似然率總和最大的組合；而分枝長度的最大似然率則是利用 General time reversible (GTR) model 來計算，其設定除核苷酸出現頻率不同外，不同核 苷酸間替換的頻率也皆不同；最大似然率的序列演化模式，則是計算不同核 苷酸替換 / 顛換率 (transition / transversion ratio) 的比例下之似然率數值，便 可選定最大似然率之演化模型。ML tree 的建構同樣以 MEGA ver. 6.0 完成，
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並以Bootstrap 重複 1000 次計算樹形信賴度之檢測。
(2) 最小關聯網狀圖 (Minimum spanning network, MSN)
先以Arlequin ver. 3.5.1.2 ( Excoffier and Lischer, 2010) 計算出兩兩單倍型 間的距離，再使用HapStar ver. 0.7 (Teacher and Griffiths, 2011) 軟體建構最小 關聯網狀圖，將近源的單倍型彼此連接，若兩單倍型間差異過大，則以空心 圓代表「假設沒採集到之中間單倍型」，將兩單倍型連接。藉網狀圖便可觀察 各單倍型間的關聯性，以及找出較原始及衍伸的單倍型，另可結合單倍型在 地理位置上的分布，探討地理位置是否和單倍型分布有關聯性。
2.3.3 族群遺傳結構分析 (1) 序列多型性分析
利 用 DnaSP ver. 5.0 (Librado and Rozas, 2009) 計 算 單 倍 型 歧 異 度 (Haplotype diversity, h) 及核苷酸歧異度 (Nucleotide diversity, π) (Nei, 1987)。
單倍型歧異度是用於估計任意由族群中挑選兩相異樣本，其單倍型發生 不同的機率，只考慮各單倍型所出現的頻度，其公式如下:
h = − 1 1 −
式中，n 為總樣本數；Xi為單倍型i 所出現的頻度；m 為單倍型的數目。
核苷酸歧異度除考量各單倍型出現的頻度外，進一步考量序列間核苷 酸組成的差異程度，其公式如下:
π = − 1
式中，n 為總樣本數；Xi為單倍型i 所出現的頻度；Xj為單倍型j 所出現的頻 度；πij為單倍型i 和單倍型 j 序列間的核苷酸差異。
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此外，Grant and Bowen (1998) 提出可依據核苷酸歧異度 (π) 及單倍型歧 異度 (h) 之高低不同的組合，用以推估可能的族群變動歷史。
(2) 遺傳分化程度
利用Arlequin ver. 3.5.1.2 計算兩兩族群間之遺傳分化指數 (ΦST; Excoffier et al., 1992)，除考慮單倍型出現頻度外，亦考慮兩兩序列間的差異程度，使用 K2P model (Kimura, 1980) 計算序列間的遺傳距離，並以 p – value 表示經 1000 次 permutations 後 ΦST值是否接受基因同質性的虛無假設 (null hypothesis of genetic homogeneity)。
再以DnaSP ver. 5.0 計算兩兩族群間之基因流傳值 (Nm)，Nm 係由遺傳分 化指數 (FST; Hudson et al., 1992) 所推導而得。公式如下:
= 1 −
式中，Hw為相同族群內序列變異之平均值；Hb為不同族群間序列變異之平均 值。將FST帶入下列公式便可得到Nm (單套型基因適用):
Nm = 1 − 1 2
式中，N 代表族群大小；m 代表每一代移入個體的基因型比例。
當 Nm 值大於 1 時表示基因交流順暢，且足以使族群遺傳結構均質化，
抵消族群間因天擇及遺傳漂變所致的族群分化；反之，若Nm 值小於 1，則表 示基因流傳受到部分阻礙 (Maruyama and Nei, 1981; Slatkin, 1987)。
(3) 分子變異分析 (AMOVA)
將各族群依照不同方式分群後，以Arlequin ver. 3.5.1.2 進行分子變異分析 (analysis of molecular variance, AMOVA)，計算三不同層級的遺傳分化指數: (1) 不同地理區間 (ΦCT)；(2) 同地理區內不同族群間 (ΦSC)；(3) 族群內 (ΦST)。
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分子變異分析檢測進行 1000 次的 permutations，並計算有多少的變異比率發 生在各層級內。
2.3.4 族群歷史動態 (1) 中性檢定
中性假說的基礎理論為，族群中的遺傳變異大部分是受到隨機的基因漂 變 (gene drift) 所影響，而非來自於天擇的作用，因此核苷酸的變異程度僅受 到突變率的快慢所影響，演化較快的基因自然擁有較多的遺傳變異 (Kimura, 1983)。利用 DnaSP ver. 5.0 計算 Tajima’s D 及 Fu’ Fs 值，並以 Arlequin ver. 3.5.1.2 計算p – value，可得知其是否接受族群大小穩定的虛無假設 (null hypothesis of constant population size)。
根據理論，若Tajima’s D 及 Fu’ Fs 值為零時，表示此 locus 符合中性假說，
且沒有族群大小變動的證據；若其為正值，表示此 locus 可能受到平衡選擇 (balancing selection)，或族群可能受到近期瓶頸效應 (recent bottleneck effect) 影響，意即族群大小縮減；若其為負值，表示此 locus 可能受到定向選擇 (directional selection)、族群大小穩定成長或族群歷經瓶頸效應後的快速擴張。
此外，相較於Tajima’s D，使用 Fu’ Fs 值來偵測族群歷史波動能夠得到更 精確的結果 (Fu and Li, 1993)。
(2) 族群變異分布檢測 (mismatch distribution)
以 DnaSP ver. 5.0 計算兩兩個體序列間相差了多少個核苷酸 (pairwise difference)，並把全部個體比較後的結果繪製成核苷酸差異個數頻率的分布圖。
若在近期曾發生族群數量或地理分布的擴張事件，族群內快速累積大量差異 小的單倍型，使圖形呈現卜瓦松 (Poisson) 的單峰分布 (unimodal distribution)；
若呈現多峰分布 (multimodal distribution)，則代表族群數量穩定發展、不同變
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異 量 的 單 倍 型 分 布 均 勻 ， 或 是 族 群 內 呈 現 明 顯 的 遺 傳 分 化 (Rogers and Harpending, 1992)。
同時，以Arlequin ver. 3.5.1.2 計算 sum of squared deviations (SSD)，檢定觀測 值分布和以族群擴張模型建立的期望值曲線有無顯著差異 (Ramos-Onsins and Rozas, 2002)；並計算 Harpending’s raggedness index (HRI; Harpending, 1994) 表示 曲線的平滑程度，HRI 值越小代表曲線越平滑。當 SSD 與 HRI 在統計上皆不顯著 時，表示族群呈現擴張狀態。