國立臺灣大學理學院海洋研究所 碩士論文
Institute of Oceanography College of Science
National Taiwan University Master Thesis
東亞島弧海域小鰭鰭尾鯙初期生活史與族群遺傳結構 之探討
Early life history and population genetic structure of Uropterygius micropterus around East Asian Island Arc
黃文謙
Wen-Chien Huang
指導教授： 蕭仁傑 博士 廖德裕 博士 Advisor: Jen-Chieh Shiao, Ph.D.
Te-Yu Liao, Ph.D.
中華民國 105 年 1 月
January, 2016
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致謝
文行至此，代表現階段的研究生涯即將畫上逗號，雖然後續的樂章會如何發 展還無頭緒，但對於現階段所完成的本篇論文，特別是能夠研究我最喜愛的裸胸 鯙，我覺得非常幸運、幸福!由衷感謝所有幫助過我的人，特別是兩位指導教授 蕭仁傑老師與 廖德裕老師，還記得當初剛甄試上找蕭老師討論論文方向時，老師 就已經告知了鰻魚研究上的困難性，但我還是很堅持想做相關的研究，老師不但 沒有責備我，反而提供了相當自由的空間及許多的資源，使我能夠自行探索研究 的樂趣，在您眼中我應該是個不聽話的學生吧!廖老師在題目方向確定後就馬上邀 約我到日本石垣島進行採樣，沿路上的討論激發了我很多新的想法，也提供了許 多方面上的照顧，尤其是在論文初步數據不樂觀時，老師的一席話更是讓我重新 持起了信心。此外也很感謝 陳韋仁老師平日對於分子生物實驗上的寶貴意見及幫 助，使我在這方面的知識成長了許多。感謝 陳鴻鳴老師在物種名稱及生態習性上 提供的建議讓我受益匪淺，陳老師對於臺灣鯙類的貢獻讓我能夠站在巨人的肩膀 上，一窺這迷人的鯙類世界。
本篇論文能夠順利完成，一定要感謝最敬愛的瑞宗學長，從一開始萌發的想 法，到現在論文的產出，一路上學長總是不斷鼓勵我要堅持、不要放棄，並告訴 我研究價值的所在，每次跟學長討論完總能信心滿滿，讓被動的我能夠握好自己 的夢想。此外在本篇研究中，樣本採集絕對是最吃重的工作之一，這裡一定要特 別感謝野外戰鬥好夥伴廖竣，總是義不容辭的伴隨我到臺灣各地、甚至是菲律賓 採集，一同討論有趣的生物議題，分擔了採集時的辛苦。樣本的採集上還要感謝 太多人，九州大學的田和篤史博士慷慨提供許多琉球群島的樣本，Florence 在菲律 賓十天的採集中一路相伴，使得採樣順利進行，邱俊勳船長及潘月惠大姊讓我在 臺東採集時能有個溫飽的居所，周銘泰大哥、鹿野雄一教授、老昌昌俊、滷豬主 峰、小強凱強、水呆柏崴、阿哲哲緯、Joel、阿柏瀠晴、小朋友力綺、舒逸、韻婷，
感謝你們在採集上的幫助。以及在電子微探儀分析上幫助我許多的飯塚義之博士 及惠合學姊。謝謝實驗室的夥伴，學長姐Nina 妮娜、阿美美璇、恩諭、黃婕、雹 舜博舜、猴子哥子喬，同屆的好哥們尚恩品仁、哥哥宏安、馬交翰駮、達達宗達，無 縫吵鬧接軌的允信、許蓁、謝瑀；延畢好戰友變態昱宣、隨便國瑋；聊天打屁好夥伴 大頭君如、小目思妤；基隆歡樂組瑋哥育瑋、白姊佳勤、大白鯊寅澤、維倫與可愛的 黑熊；感謝我的爸爸、媽媽與哥哥，總是無限支持鼓勵我完成自己的夢想，讓我毫無 顧慮的完成學業。
本研究能夠順利完成，要感謝的人實在太多，原諒我無法逐一列出，每個你 都是無法取代的。最後，畢業並不是本研究的終點，只要還有一口氣在，我便會 持續努力延續本篇的研究，繼續探索裸胸鯙迷人的世界。
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摘要
幼生漂浮期 (Pelagic larval duration, PLD) 的擴散與補充，可能對於底棲性魚 類成體的分布範圍及族群結構有重要影響。本研究對象小鰭鰭尾鯙 (Uropterygius micropterus) 具有廣分布、在地產卵、成熟體型小、移動能力低及棲位寬度 (Niche breadth) 狹窄等特性，值得從幼生漂浮期與族群遺傳結構探究上述物種特性。小鰭 鰭尾鯙採自三個國家八個樣點共176 尾：(1) 日本石垣島 (Ishigaki)；(2) 臺灣大溪、
石梯坪、基翬、車城黃金海岸、萬里桐及小琉球；(3) 菲律賓巴迪安 (Badian)。以 粒線體DNA 之 cyt b 與 COI 基因串聯作為分子標記，探討小鰭鰭尾鯙之族群遺傳 結構，並以矢狀石 (Sagitta) 之微細結構估計 PLD 日齡，輔以輪寬及鍶鈣比的時序 變化，探討其早期生活史之漂送機制。結果顯示，小鰭鰭尾鯙擁有高單倍型歧異 度 (h) 及低核苷酸歧異度 (π) ，中性檢定之 Fu’s FS各族群皆為顯著負值，代表族 群有擴張的現象。重建最大似然親緣關係樹 (Maximum likelihood tree) 及最小關聯 網狀圖 (Minimum spanning network) 顯示沒有明顯的分群及地理分布趨勢。分子 變異分析 (AMOVA) 顯示主要變異來自族群內，族群間遺傳分化指數 (ΦST) 介於 -0.02476 到 0.12067 之間。分子證據顯示小鰭鰭尾鯙曾經歷族群擴張，且各族群間 基因交流順暢。PLD 介於 33 到 98 天，將樣本分為三個不同緯度來分析，平均 PLD 日齡隨緯度往北有增加的趨勢，耳石平均成長率則相反，顯示小鰭鰭尾鯙初期成 長速率可能受到水溫所影響。僅分析臺灣地區樣本數超過三十尾的族群 (石梯坪、
基翬及黃金海岸)，發現臺灣東側兩樣點之平均日齡數 (51.8 ± 7.2 及 51.7 ± 7.9 天) 顯著小於西南側的樣點 (57.6 ± 9.7 天)，推測和臺灣東西側洋流系統的差異有關聯。
綜合上述結果，小鰭鰭尾鯙利用狹首幼生 (Leptocephalus) 的長 PLD 使基因在東亞 島弧間交流順暢，因此有高基因同質性 (Genetic homogeneity)，但海水溫度及洋流 系統等環境因子可能影響小鰭鰭尾鯙的初期生活史特徵。
關鍵字: 小鰭鰭尾鯙、粒線體 DNA、耳石、幼生漂浮期、族群遺傳結構
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Abstract
Pelagic larval duration (PLD) of demersal fishes may play an important role to shape adult distribution patterns and population genetic structures. However, the relationship between PLD and population genetic structure remains unclear for Uropterygius micropterus, which has wide distribution, local spawning, poor adult migration ability and narrow niche breadth. Population genetic structure of U.
micropterus collected from 8 locations, 3 countries (Japan, Taiwan and Philippines) were analyzed using cyt b and COI genes of mtDNA. Microstructure of otoliths were examined to estimate the PLD and otolith growth rate to investigate the mechanism of larval dispersion. The results showed high haplotype diversity (h) and low nucleotide diversity (π). No population can be distinguished by maximum likelihood phylogenetic tree and minimum spanning network. The AMOVA results demonstrated that > 99 % of genetic variations occur within populations and values of pairwise ΦST ranged from -0.02476 to 0.12067, indicating little to no geographic population genetic structure. The daily increments for all samples ranged from 33 to 98 days. PLD was shorter and otolith growth rate was higher for the eels collected in Philippines. Higher water temperature might explain the shorter PLD and faster growth rate. PLD of two populations from eastern Taiwan (51.8 ± 7.2 and 51.7 ± 7.9 days) were significant shorter than the population from southwestern Taiwan (57.6 ± 9.7 days). This result was most likely caused by different ocean current systems between eastern and southwestern Taiwan.
Key words: Uropterygius micropterus, mtDNA, otolith, pelagic larval duration (PLD), population genetic structure
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目錄
致謝 ... i
中文摘要 ... ii
英文摘要 ... iii
表目錄 ... vi
圖目錄 ... vii
附錄 ... viii
壹、前言 ... 1
1.1 鰻形目魚類的早期生活史 ... 1
1.2 親緣地理與族群遺傳結構 ... 4
1.3 耳石於鰻形目魚類早期生活史的運用 ... 7
1.4 鯙科魚類簡介 ... 8
1.5 研究目的 ... 11
貳、材料方法 ... 14
2.1 野外樣本採集 ... 14
2.2 分子生物實驗 ... 15
2.3 序列資料分析 ... 18
2.4 耳石樣本製備 ... 23
2.5 耳石數據及年齡成長分析 ... 25
參、結果 ... 28
3.1 樣本採集 ... 28
3.2 分子生物實驗 ... 29
3.3 耳石分析結果 ... 32
肆、討論 ... 38
v
4.1 小鰭鰭尾鯙的族群遺傳結構 ... 38
4.2 小鰭鰭尾鯙耳石結構與化學 ... 43
4.3 小鰭鰭尾鯙幼生的成長與漂送機制 ... 48
4.4 鯙科魚類的保育 ... 53
伍、結論 ... 55
陸、參考文獻 ... 56
vi
表目錄
表一、小鰭鰭尾鯙採集資料………...77
表二、小鰭鰭尾鯙 cyt b – COI 之基因多型性………...78
表三、小鰭鰭尾鯙 cyt b – COI 基因之 Pairwise ΦST與Nm………79
表四、小鰭鰭尾鯙 cyt b – COI 基因之 AMOVA 檢定………80
表五、所有小鰭鰭尾鯙族群之耳石日輪數………...81
表六、小鰭鰭尾鯙依不同國家代表不同緯度之耳石日輪數………...82
表七、小鰭鰭尾鯙超過30 尾樣點之耳石日輪數………..83
表八、所有小鰭鰭尾鯙族群之耳石成長率………...84
表九、小鰭鰭尾鯙依不同國家代表不同緯度之耳石成長率………...85
表十、小鰭鰭尾鯙超過30 尾樣點之耳石成長率………..86
表十一、臺灣地區小鰭鰭尾鯙之年齡體長關係 (Age-Length Key)………87
表十二、鰻形目魚類之基因多樣性………...88
vii
圖目錄
圖一、小鰭鰭尾鯙各族群採集地點分布圖………...89
圖二、小鰭鰭尾鯙標本照………...90
圖三、小鰭鰭尾鯙之不同類型棲地環境照………...91
圖四、全部小鰭鰭尾鯙樣本物種鑑定之 COI 親緣關係樹 (NJ tree)………...…92
圖五、小鰭鰭尾鯙種內 cyt b – COI 基因之親緣關係樹 (ML tree)………..93
圖六、小鰭鰭尾鯙 cyt b – COI 基因之最小關聯網狀圖 (MSN)………..94
圖七、小鰭鰭尾鯙 cyt b - COI 基因之遺傳變異分布檢測………95
圖八、小鰭鰭尾鯙耳石之透明帶 (translucent zone) 與不透明帶 (opaque zone)…..96
圖九、小鰭鰭尾鯙耳石微細結構及微化學………...97
圖十、小鰭鰭尾鯙耳石輪寬與Sr / Ca 之時序變化………...98
圖十一、小鰭鰭尾鯙全部樣本耳石TGC分布圖………100
圖十二、小鰭鰭尾鯙依不同國家代表不同緯度之TGC百分比分布圖………..101
圖十三、臺灣本島東側與西南側小鰭鰭尾鯙TGC百分比分布圖………..102
圖十四、小鰭鰭尾鯙全部樣本TGC輪寬時序變化圖………..103
圖十五、小鰭鰭尾鯙全部樣本TGC輪寬時序變化圖 (10 輪為間距)……….104
圖十六、小鰭鰭尾鯙全部樣本TGC輪寬時序變化圖 (20 輪為間距)……….105
圖十七、臺灣地區小鰭鰭尾鯙體長體重關係圖……….106
圖十八、小鰭鰭尾鯙耳石年輪結構……….107
圖十九、菲律賓巴迪安 (BD) 小鰭鰭尾鯙耳石結構……….109
圖二十、小鰭鰭尾鯙年齡判讀示意圖……….110
圖二十一、臺灣地區小鰭鰭尾鯙之成長曲線……….111
圖二十二、小鰭鰭尾鯙第一次與第二次讀輪結果比較圖……….112
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附錄
附錄一、鯙科魚類 (Muraenidae) mtDNA 及引子增幅片段示意圖………...113
附錄二、鰻形目物種成長方程式 (VBGE) k 與 L∞之關係……….114
附錄三、大海鰱狹首幼生變態時耳石之微細結構與微化學……….115
附錄四、日本、臺灣及菲律賓地區5 – 12 月之平均海表面水溫 (°C)………...116
附錄五、歷年臺灣周圍海域5 月至 12 月 50 m 以淺平均海流流向及流速圖………117
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壹、前言
1.1 鰻形目魚類的早期生活史
1.1.1 幼生的發育過程
海鰱總目 (Elopomorpha) 是真骨魚類 (Teleostei) 中最古老的分類群，由海鰱 目 (Elopiformes)、狐鰮目 (Albuliformes)、背棘魚目 (Notacanthiformes) 及鰻形目 (Anguilliformes) 所 組 成 (Chen et al., 2014) ， 特 殊 的 幼 生 階 段 - 狹 首 幼 生 (leptocephalus) 是海鰱總目下成員的共同特徵。
以鰻形目魚類來說，剛孵化的幼生呈細長型，頭部比例相對大，只有發育未 完全的眼構造，牙齒細小或無，營養來源全來自油球 (oil globule) 及卵黃囊 (yolk sac)，此階段稱作前狹首幼生 (preleptocephalus)；繼續成長後，當營養源吸收殆盡、
眼及牙齒完全形成時，即進入狹首幼生階段 (Miller, 2009)。Leiby (1989) 將狹首幼 生細分為兩個階段，首先為具齒期 (engyodontic stage)，此時的幼生具有數量少但 大而尖銳、向前生長的牙齒；當其繼續生長，大而尖銳的牙齒被吸收成為小而數 量多的尖牙，體高明顯增加，形狀變得側扁且頭部相對狹小，即進入 euryodontic stage (Leiby, 1989)，因細胞間隙充滿透明的膠狀物質，且循環系統缺乏紅血球及有 功能的鳃因此全身透明，加上大的表面積非常適合在洋流中漂流，是鰻魚幼生最 主 要 的 擴 散 階 段 。 當 狹 首 幼 生 漂 流 至 適 合 的 生 長 環 境 時 ， 即 開 始 變 態 (metamorphosis) 為透明的玻璃鰻 (glass eel) 時期，身體由扁平轉為圓筒狀，擁有 較佳的游泳能力且適合行底棲生活，主動游動離開洋流並開始沉降進入juvenile 及 adult 之棲地生長 (Miller, 2009)。
1.1.2 狹首幼生的成長及漂流時間
隨著許多鰻鱺科 (Anguillidae) 魚類的耳石成長輪紋已被證實在早期生活史階
2
段為一天沉積一輪 (Tsukamoto, 1989; Umezawa et al., 1989; Martin, 1995; Arai et al., 2000a; Cieri and McCleave, 2001; Sugeha et al., 2001; Shinoda et al., 2004)，藉著計算 日輪數目，便可得知狹首幼生的漂流時間 (Pelagic larval duration, PLD)，進一步可 估算該魚種的出生地或成長速率等資訊。鰻魚狹首幼生的PLD 長短差異頗大，往 往 和 其 生 活 史 策 略 相 關 ， 短 則 數 十 天 ， 如 鯙 科 (Muraenidae) 及 海 鰻 科 (Muraenesocidae) 的魚類 (Brothers and Thresher, 1985; Ling et al., 2005; Reece et al., 2011)，這類的物種通常是在地或近海產卵者 (Moyer and Zaiser, 1982; 陳等，1994;
Kimura et al., 2006)；長則百餘天甚至近一年者皆有，如鰻鱺科及某些糯鰻科 (Congridae) 的物種 (Otake et al., 1997; Arai et al., 2000b; Antunes and Correia, 2003)，
而 這 類 的 物 種 通 常 在 生 殖 季 時 會 進 行 長 距 離 的 洄 游 至 固 定 的 產 卵 場 交 配 (McCleave and Miller, 1994; Kuroki et al., 2009; Kurogi et al., 2012)。
此外，狹首幼生的成長速率也是重要的一環，McCormick (1999) 認為幼生變 態沉降的最小日齡是受到其成長速率所控制。過去許多關於淡水鰻的研究指出，
熱帶鰻和溫帶鰻在成長特徵上有明顯的不同，如熱帶鰻狹首幼生的最大體型較小 且遷徙的距離較短等 (Tesch, 1980; Kleckner and McCleave, 1985; Bast and Strehlow, 1990)。Kuroki et al. (2006) 比較棲息於印尼的四種熱帶淡水鰻，發現幼生成長率隨 著幼生從產卵場所遷徙距離的增加有減少的趨勢；Kuroki et al. (2009) 比較了在索 羅門群島南側所採集到的兩種淡水鰻幼生，發現雖然在相同的水溫之下，但屬熱 帶種類的寬鰭鰻鱺 (A. reinhardtii) 比起屬溫帶種類的澳洲鰻鱺 (A. australis) 有著 更高的成長速率。Miller (2009) 根據上述結果提出一假說，認為狹首幼生的成長速 率會和其從產卵場遷徙的距離長度呈相關。關於海洋鰻魚物種的研究，Ma et al.
(2005) 研究採自東海重疊測站的兩個物種 Saurenchelys stylura 及 Dysomma sp.，發 現 S. stylura 的成長速率 (0.68 mm day-1) 顯著高於 Dysomma sp. (0.44 mm day-1)，
同時，S. stylura 狹首幼生的極限體長 (~ 150 mm) 也明顯大於 Dysomma sp. (~80 mm)，由此可見在海水鰻形目魚類中，極限體長越大的狹首幼生可能具有越高的成
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長速率。
除此之外，Umezawa and Tsukamoto (1991) 及 Fukuda et al. (2009) 在人工飼養 環境下利用耳石研究日本鰻 (A. japonica) 在不同餵食及溫度條件下的成長速率，
發現餵食與否和水溫對耳石的成長速率都具正相關，且溫度的影響較大，當水溫 低於10 °C 時耳石便停止成長。Han (2011) 測試了不同鹽度及水溫對於日本鰻玻璃 鰻發育階段的影響，發現水溫較高的實驗組在飼養兩個月後皆處在較晚期的色素 發育階段，而低水溫的組別則停留在早期階段，鹽度則沒有影響，顯示溫度對於 鰻魚幼生的發育亦會造成影響。
綜合上述的研究皆證明狹首幼生的PLD 與幼生成長速率可能受到遷徙距離、
食物豐度、水溫高低以及其他環境因素所影響。
1.1.3 狹首幼生的變態
變態是狹首幼生與玻璃鰻階段間的重要轉變期，狹首幼生將失去有利於大洋 表層漂浮的生存能力，取而代之的是適合在海洋底層或中層棲息的特性。為了適 應幾乎完全不同的棲息環境，其身體結構上改變相當大，在變態期間，狹首幼生 的體型將逐漸由側扁變為圓桶型，體長甚至會縮減不少，最後變為如同成體般的 標準鰻魚身型，這樣的身體構造賦予其更強的游泳能力，是狹首幼生能夠主動游 動脫離洋流到達棲息地的重要因素之一 (Miller, 2009)。除此之外，身體上的特徵 變化還包括頭部増厚、背鰭臀鰭起點向身體前方位移等，鰓、感覺器官及骨骼系 統也逐漸發育完全 (Miller, 2009)。生理上的改變同樣顯著，大量存在於狹首幼生 表皮細胞的葡萄胺聚糖 (glycosaminoglycan, GAG; Pfeiler et al., 2002) 將分解提供 骨骼系統發育及變態期間所需的能量，同時甲狀腺素 (thyroid hormone) 會快速增 加，伴隨皮質醇 (cortisol) 的大量減少 (Yamano et al., 1991)，有些種類在變態後期 時紅血球也跟著形成 (Miller, 2009)。
雖然目前對於實際引發變態的因子或機制還不清楚，但一般認為和兩項條件
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因素有重要關係:(1) 最小變態體型; (2) 適合的環境誘發因子。最小變態體型是基 於狹首幼生本身是否累積了足夠的能量進行變態，這樣的論點已有實驗和野外觀 察數據可以間接驗證 (Liao et al., 1996; Tanaka et al., 2001)；Miller (2009) 也提出觀 點，認為最小的變態體型或年齡或許對於海洋中層性的鰻魚幼生而言格外重要，
因為海洋中層環境相較沿岸淺海環境來得穩定，若狹首幼生變態後直接沉降至海 洋中層棲地，其變態過程將不受到沿岸因子的影響，變態年齡或體型將會顯著影 響成體分布範圍。適合的環境誘發因子也是重要的因素，因為攸關狹首幼生能否 順利沉降到適合的棲地，對於棲息在淺海、沿岸及淡水棲地的物種而言，若幼生 在到達適合棲地前或在外洋時就已經完成變態，會因無法適應大洋開放水域的環 境而死亡。因此一般認為，狹首幼生能夠偵測周遭環境因子決定其是否進行變態，
如鹽度、深度及化學組成等，這和其開始變態時快速發育的感覺器官亦有不謀而 合之處。此外已經有研究報告指出，珊瑚礁魚類幼生若沒偵測到適合的沉降環境，
有能力可以適度的延遲變態開始的時間 (Victor, 1986; McCormick, 1999)。蕭 (2002) 統整了上述兩個因素，認為狹首幼生的變態條件為，必須先成長到變態所需的最 小體長 (蓄積足夠能量)，並且在變態前具有一段緩衝期，使其能有更多的機會尋 找到適合的棲地並進行變態。
1.2 親緣地理與族群遺傳結構
1.2.1 PLD 與族群遺傳結構的關係
親緣地理學 (Phylogeography) 是生物地理學 (Biogeography) 中的一個分支，
係由動物學者Avise et al.(1987) 所提出，是一門專門研究動物本身遷徙能力及地質 歷史事件，如何影響造成現生物種地理分布的學問。早期學者認為標準的海洋魚 類具廣分布、族群數量大以及漂浮性的卵及幼生，加上海洋中相對淡水環境有著 更少的物理性屏障 (physical barriers)，幼生可以藉由洋流漂送至廣大的範圍，因此
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族群間應只有微弱的、或沒有族群結構，且近乎隨機交配 (Gyllensten, 1985; Taylor, 1991; Palumbi, 1994; Ward et al., 1994; Adkison, 1995; Waples, 1998)；而只靠成體進 行擴散的珊瑚礁魚類，在數十公里的距離尺度下便會形成族群結構 (Bernardi, 2000)。由上述可知，漂浮性的幼生階段 (即 PLD) 對珊瑚礁魚類的擴散及族群間 的基因交流有著重要的影響。
最直觀的預測是，PLD 越長的物種其族群間的基因交流便越順暢 (Jones et al., 2005; Taylor and Hellberg 2005)，雖有研究符合這樣的預測 (Craig et al., 2007)，但 更多的研究指出，許多珊瑚礁魚類比起利用PLD 預期的結果有著更強的族群結構 (Bernardi et al., 2003; Taylor and Hellberg, 2003; Bowen et al., 2006; Thacker, et al.
2007)。Bowen et al. (2006) 比較了 15 種珊瑚礁魚類 PLD 和遺傳分化指數 (ΦST) 間 的關係，發現兩者間並沒有顯著的相關性，更凸顯了PLD 並非唯一影響族群結構 的因子。其他可能的影響因子，包括自然環境的屏障如ocean gap、冰河時期會露 出水面的淺礁、淡水河川的注入、不同的洋流系統等 (Bowen et al., 2006; Reece et al., 2010)，以及魚類的生態習性，如成體對棲息環境的專一程度 (Rocha et al., 2002) 及覓食習性 (Robertson et al., 2004) 等因子都會影響族群遺傳結構。
此外，Robertson (2001) 和 Irisson et al. (2004) 認為，比起珊瑚礁魚類幼生長 距離的擴散，族群的自我補充 (self - recruitment) 亦同等重要。幼生長距離的擴散 可促使族群分布廣泛，Bonhomme and Planes (2000) 就發現到，擁有越長 PLD 的 珊瑚礁魚類出現在隔離島嶼的機率也越大；當地族群的自我補充則有較高機會促 使種化的發生，Hourigan and Reese (1987) 發現夏威夷群島特有的珊瑚礁魚類多半 擁有相對短的 PLD。而族群自我補充還有另外一項重要的功能，即降低當地的族 群滅絕的風險，這對棲息在偏遠隔離小島的物種來說格外重要。因此，生物必須 在這兩者之間取得平衡，以達到最大的生物利益。
1.2.2 鰻形目魚類的族群遺傳結構
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有關鰻魚族群遺傳結構的研究相當多，主要以重要經濟性物種的鰻鱺科為主，
皆是淡水的物種並有相同的生殖策略:降海生殖洄游 (catadromy) 回到固定產卵場 生育，幼生再經洋流漂送到河川棲地。過去的研究指出屬溫帶種類的日本鰻鱺 (A.
japonica; Ishikawa et al., 2001)、美洲鰻鱺 (A. rostrate; Wirth and Bernatchez, 2003)、
歐 洲 鰻 鱺 (A. anguilla; Dannewitz et al., 2005)以及熱帶種類的寬鰭鰻鱺 (A.
reinhardtii; Shen and Tzeng, 2007) 皆屬單一隨機交配之族群。然而，由於不同分子 標記擁有不同的解析能力，有時也會出現相悖的結果，如Ishikawa et al. (2001) 利 用粒線體DNA 分析顯示日本鰻鱺為單一隨機交配族群，但 Tseng et al. (2006) 利用 微衛星DNA (microsatellite DNA) 卻認為其可分為高緯度群及低緯度群。亦有不同 分子標記分析結果相符的例子，如Minegishi et al. (2008) 同時利用粒線體及微衛星 DNA 探討花鰻鱺 (A. marmorata) 的族群遺傳結構，結果一致顯示其至少可分為四 個不同地理區的生殖族群，而實際已知的花鰻鱺產卵場卻只有一個，可能還有其 他產卵場尚未被發現，充分表現了分子生物技術運用在生物生活史研究上的實用 性。
海水鰻魚物種的研究相對較少，主要可以分為兩類不同的生殖模式:在地產卵 型，這類魚種不會進行生殖遷徙，只會在成體生長的棲地繁殖，如Moyer and Zaiser (1982) 所記錄的蠕紋裸胸鯙 (Gymnothorax kidako)；另一種模式則是性成熟的個體 會在生殖季節遷徙聚集到某幾個特定的產卵場進行繁殖，如箭齒前肛鰻 (Meadia abyssalis) 就曾被記錄聚集在 400 m 深的海底山脈進行交配 (Fricke and Tsukamoto, 1998)，有些種類遷徙的距離甚至相當於鰻鱺科的物種，如繁星糯鰻 (Conger myriaster) 的產卵場就在距成體棲息地數千公里外的九州 - 帛琉海脊附近被發現 (Kurogi et al., 2012)。雖然各物種生殖模式不同，普遍的族群遺傳結構研究卻顯示 了相似的結果，如會進行長距離生殖遷徙的繁星糯鰻及歐洲糯鰻 (C. conger) 的研 究發現沒有族群遺傳結構存在 (Kimura et al., 2004; Correia et al., 2012)；棲息在低 潮線附近沙泥質地形的中華鬚蛇鰻 (Cirrhimuraena chinensis) 普遍被認為定居且
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沒有長距離遷徙的能力，研究亦顯示沒有族群遺傳結構存在 (Li et al., 2014)。Reece et al. (2010, 2011) 針對四種不同棲位寬度 (niche breadth) 的鯙科魚類進行大範圍 的採樣，樣點遍及印度洋及整個太平洋區域，包含了該物種所有的分布範圍以及 兩個主要的地理屏障: (1) Eastern Pacific Barrier (EPB) 為 5000 – 7000 km 的 ocean gap 將東太平洋及中太平洋的珊瑚礁棲地隔離；(2) Sunda Shelf (SS) 為印尼婆羅洲、
蘇門答臘與馬來西亞、中南半島間的一連串淺礁，被認為在冰河時期會露出水面，
將印度洋與太平洋隔離。分析結果顯示，無論棲位寬度如何，四個物種在橫跨22000 km 的棲地環境中幾乎沒有族群遺傳結構出現，作者認為鯙科魚類利用長 PLD 的擴 散，在短時間內就足以抹去暫時性地理屏障所造成的族群分化 (Reece et al., 2010)。
由上述研究可知，鰻形目的魚類利用狹首幼生漂浮期的擴散能力使各族群間基因 交流順暢，形成微弱或幾乎沒有族群結構的現象。
1.3 耳石於鰻形目魚類早期生活史的運用
自Pannella (1971) 在溫帶魚類的耳石中證實日週期性的輪紋構造後，往後的 研究便使魚類的年齡判讀可精確到以日為單位。魚類耳石輪紋的形成主要受到內 部生理因子及外在環境因素所調控，以日週輪來說，日行性魚類在日間活動進食，
生理代謝速率較高，耳石沉積速度亦較快，因此形成較寬且透光性較高的連續帶 (continuous zone)，而在夜間時，魚類停止進食並呈現睡眠狀態，生理代謝緩慢，
耳石沉積速率也減緩，因此形成輪寬較窄且較不透光的不連續帶 (discontinuous zone)，藉由上述條件，便可得知一連續帶加上一不連續帶即為一天耳石所沉積的 日週輪 (Pannella, 1971)。
耳石中所包含的微量元素和環境中元素的組成及濃度相關，元素從環境沉積 到耳石中是一複雜的過程，首先會先經由鰓或腸道上皮進入血液中，再經過內耳 球囊上皮進入淋巴液，最後沉積於耳石上 (Campana, 1999)，因此，經由分析耳石 上的次要與微量元素，配合耳石所提供的時間序列資訊，便可用來建立魚類生活
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史所歷經的棲地環境改變。
鍶元素 (Sr) 是海洋中富含的一種二價離子，在淡水中則相當稀少，而鈣元素 (Ca) 是耳石主要組成的結構成分之一，其含量在耳石中相當穩定，因此藉由鍶和 鈣的比值 (Sr / Ca) 便可用來推測魚類在淡海水間遷徙的生活史過程。在早期，有 些學者發現鰻鱺科魚類的狹首幼生在變態時Sr / Ca 會急遽下降，推測可能是因為 遷徙到河口淡水環境準備上溯所致 (Tzeng and Tsai, 1994)，但隨後更多研究發現純 海水的鰻魚物種亦有相同的情況 (Correia et al., 2004; Ling et al., 2005)，因此推測 狹首幼生變態時Sr / Ca 的急遽變化可能是由生理因素改變所引起，而非環境 Sr 濃 度的改變，並認為Sr / Ca 的忽然下降是因為 GAG 的快速分解，GAG 對於二價離 子有很強的吸收力，狹首幼生變態後大量失去GAG 導致對於二價鍶 (Sr2+) 的吸收 能力降低 (Pfeiler, 1986; Pfeiler, 1991)。在變態開始時，除了 Sr / Ca 急遽下降外，
從耳石微細結構的研究中亦發現，耳石輪寬在此時會忽然變寬，在多種淡水鰻 (e.g., A. australis, A. celebesensis, A. dieffenbachia, A. marmorata)、海水鰻 (e.g., Conger oceanicus) 及海鰱 (Megalops cyprinoides) 中皆是如此。藉著 Sr / Ca 驟降及耳石輪 寬變寬這兩項特徵，便可判定開始變態的時間點，並計算變態前後不同階段所相 對應的日輪數目，用來推測該魚種的產卵場及生活史策略等資訊 (Marui et al., 2001; Correia et al., 2004; Lee et al., 2008)。
1.4 鯙科魚類簡介
1.4.1 鯙類概述
鯙類屬輻鰭魚綱 (Actinopterygii)、鰻形目 (Anguilliformes)、鯙科 (Muraenidae)，
廣泛分布在全球熱帶與溫帶的淺海環境中，目前世界約有15 屬 200 餘種 (Nelson, 1994)，根據 Ho et al. (2015) 的研究，臺灣目前的鯙類物種有 13 屬 71 種，超過世 界的三分之一，為鯙類多樣性最高的區域之一。鯙科主要可分為兩個亞科，分別
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為鯙亞科 (Muraeninae) 及鰭尾鯙亞科 (Uropterygiinae)，主要區別為鯙亞科背、臀 及尾鰭相連且明顯，而鰭尾鯙亞科各鰭局限於尾部末端，有時並不明顯。鯙類為 淺海生態系中的高階掠食者，對於環境中魚類數量的控制有重要影響，同時也是 其他生物的重要食物來源，如黑唇青斑海蛇 (Laticauda laticaudata) 與黃唇青斑海 蛇 (L.colubrina) 皆以鯙類作為主要捕食對象 (朱，2010)。鯙類體型大小及體色花 紋變異頗大，大型種類如長鯙 (Strophidon sathete) 及爪哇裸胸鯙 (G. javanicus) 成 熟體型可達 3 公尺，相對如小鰭鰭尾鯙 (Uropterygius micropterus) 及李氏裸胸鯙 (G. richardsonii) 卻只有 30 餘公分，大型物種經常展示於水族館，小型種則適合作 為觀賞魚，此外，野生環境中的野生鯙類經適度馴化後，往往能帶來可觀的觀光 收入。鯙類同時亦是重要的經濟性魚類，由於其肉質富含膠質，傳統上被認為能 夠補氣養生，市場更以臺斤秤重販售。國際民間盛行的珊瑚礁體檢 (reef check) 更 將鯙類列為調查時指標性的珊瑚礁魚種，可見其對環境之重要性。
1.4.2 鯙類的生殖與移動能力
有關鯙類生殖行為的研究，日本學者Moyer and Zaiser (1982) 描述了日本三宅 島 (Miyake - jima) 兩種鯙類的自然交配行為，蠕紋裸胸鯙的求偶發生在 8 月 15 號的下午16 : 30 之後，持續約兩小時，並觀察到直徑約 2 mm 的透明浮性卵；巨 頭鰭尾鯙 (U. macrocephalus) 則是發生在 7 月 29 號的下午 19 : 03 之後，但並無觀 察到受精卵形成。隨後，已有多種鯙類被觀察到在人為飼養環境下的自然求偶產 卵行為，如細點裸胸鯙 (G. pictus; 羅，2003)、密點裸胸鯙 (G. thyrsoideus; Chang and Liao, 2000; 羅，2003) 及管鼻鯙 (Rhinomuraena quaesita; Preininger et al., 2015) 等。
早期學者研究了數種鯙類的行為模式 (e.g., G. moringa, G. vicinus, Muraena miliaris)，發現其會不斷地更換庇蔭處，平均一到兩天就會移動一次 (Abrams et al., 1983; Young and Winn, 2003)。Bassett and Montgomery (2011) 更進一步利用聲學發
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報接收器以及人工監測的方式，共監測了五尾 G. prasinus，發現其會在一定的活動 範圍內 (1561 ~ 10226 m2 ) 頻繁地更換庇蔭處，且每個庇蔭處所使用的次數不會超 過一次；此外作者亦將 G. prasinus 和其他食性相似的魚類比較，發現其活動範圍 相較下小了許多 (Matthews, 1990; Bradbury et al., 1995; Lowry and Suthers, 1998;
Lowe et al., 2003)，認為是因為鯙類和其他鰻形目魚類有著類似的游泳模式以及負 浮力，使其在短時間內無法做長距離的移動 (Bassett and Montgomery, 2011)。
由上述多篇研究得知，鯙類在自然環境的生殖行為在原棲地被觀察到，亦可 在人工飼養條件下自然交配並產生受精卵，加上其只有相對小的活動範圍，增加 了鯙類為在地產卵型物種的可信程度。
1.4.3 小鰭鰭尾鯙的文獻回顧
小鰭鰭尾鯙(Uropterygius micropterus; Bleeker, 1852) 的分類為鯙科、鰭尾鯙亞 科、鰭尾鯙屬 (Uropterygius)，屬小型鯙類，目前紀錄的最大體型為 37.30 cm (田，
2004)，陳 (1997) 認為其棲息在潮間帶或亞潮帶之珊瑚岩礁海岸，活動水深通常 在3 m 以內，主要捕食小型無脊椎動物或魚類。
小鰭鰭尾鯙廣泛分布在印度-太平洋海域，西至東非的莫三比克 (Pereira, 2000)，
東至薩摩亞 (Wass, 1984)，北至日本南部 (Motomura et al., 2010)，南至澳洲 (Gledhill et al., 2009)，在紅海 (Golani and Bogorodsky, 2010)、馬里亞納群島 (Myers and Donaldson, 2003) 也都有紀錄。臺灣地區小鰭鰭尾鯙的分布，根據臺灣魚類資 料庫的描述，分布於南部、東部及北部，離島地區則包括小琉球、綠島及蘭嶼。
而田 (2004) 於 2001 – 2003 年間對臺灣周邊海域小鰭鰭尾鯙採樣的結果顯示，臺 東成功的基翬樣點具有最高的密度，小琉球次之；北部樣點基隆平浪橋及西部澎 湖樣點均無採集到，顯示北部地區小鰭鰭尾鯙的族群密度可能非常低，而西部地 區分布的最北界則到小琉球為止。此外，依據中國動物誌-硬骨魚綱鰻鱺目背棘魚 目 (張等, 2010) 的描述，中國沿岸地區並沒有小鰭鰭尾鯙的分布。
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關於小鰭鰭尾鯙生殖方面的文獻，McCosker et al. (1984) 在檢視日本產鰭尾鯙 屬鯙類樣本時，觀察到一尾於9 月 3 日在德之島 (Tokunoshima) 所採集到 23.6 cm 的小鰭鰭尾鯙樣本腹腔內具成熟的卵粒。陳等 (1994) 在臺東成功沿海潮間帶記錄 了小鰭鰭尾鯙的生殖行為，根據描述，在夏季的生殖季時，小鰭鰭尾鯙會進行強 烈的求偶行為，多尾雄鯙纏繞一尾雌鯙，並唅咬雌鯙頭胸部及其他身體部位，求 偶期間不畏懼人為活動，在入夜後約20 : 00 後觀察到霧狀白色精液及懸浮的透明 受精卵。田 (2004) 描述了小鰭鰭尾鯙的生殖腺外觀及生殖腺指數，並發現雌鯙與 雄鯙在外觀上有不同的特徵。羅 (2009) 檢視了 9 尾小鰭鰭尾鯙雌鯙樣本，認為雌 鯙的最小成熟體長為25.1 cm，體重為 13.9 g，性成熟月份為 8 月。
總結上述，小鰭鰭尾鯙擁有以下生物特性: (1) 體型小，相對移動能力弱；(2) 僅 棲息在3 m 以內的潮間帶及亞潮帶區域，生態棲位狹窄；(3) 分布範圍廣泛，遍及 印度-西太平洋地區；(4) 在地產卵。適合作為研究鯙類幼生漂送機制及族群結構 的代表物種。
1.5 研究目的
目前關於鯙類的文獻主要為新種 (Chen and Shao, 1995; Chen et al., 1996; Chen and Loh, 2007; Chen et al., 2008; Loh et al., 2011)、新紀錄種 (Chen et al., 1994; Loh et al., 2013) 之描述，基礎生物學研究 (歐，2007; 黃，2008; 張，2009; Matić-Skoko et al., 2011)，多樣性調查 (陳，2003; 簡，2008)，行為學研究 (田，2004; Mehta and Wainwright, 2007; Barley et al., 2015) 及狹首幼生種類鑑定 (Tawa et al., 2012; Tawa et al., 2014)。但對於鯙類漂送機制的研究卻非常貧乏。
陳 (2003) 於 2001 – 2002 年間對臺灣周圍海域 21 個樣點進行鯙類多樣性普查，
共調查到 7 屬 35 種鯙類 (包括疑似新種的種類，當時臺灣登錄的物種數為 13 屬 51 種)，比對兩年的資料後，發現多種一般市場常見的販售物種數量皆減少了 20 %，
共5 屬 21 種平均體長有下降的情形，且共有 17 種鯙類在調查期間沒有發現。作
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者以當時農委會野生動物諮詢委員工作小組建議的「保育類動物名錄評估分類準 則」及世界自然保育聯盟IUCN 所發展的紅皮書 (Red list categories)，針對罕見種 黃斑蝮鯙 (Echidna xanthospilos) 及臺灣鬍鯙 (Cirrimaxilla formosa) 進行瀕危程 度評估，結果顯示黃斑蝮鯙可列為「珍貴稀有的保育野生動物」，臺灣鬍鯙為「瀕 臨絕種保育野生動物」，且此兩種皆達紅皮書中的瀕臨滅絕 (Endangered, EN) 標準。
簡 (2008) 於 2004 – 2008 年間對臺灣東南海域之新港漁會及標本戶進行鯙類多樣 性調查，無論個體平均重量、歧異度、均勻度及豐富度皆有逐年下降的情形。以 上研究皆顯示自然環境中的鯙類資源正在減少且組成正在改變。
上述資訊顯示鯙類的保育刻不容緩，而保育政策的制定需要大量的基礎生物 資料。幼生漂送機制與成體分布、族群間基因的交流等有著重要的因果關係，是 保育該物種不可或缺的重要資訊。雖然Reece et al. (2010, 2011) 已經針對四種不同 鯙類進行大規模的採樣，並發現在整個印度洋及太平洋間並無明顯族群遺傳結構 存在，但此篇研究卻有幾項缺陷，第一，大部分族群的樣本數量少於10 尾，樣本 數量的不足可能會對族群遺傳結構分析的結果造成影響，舉例來說，研究中的疏 斑裸胸鯙 (G. undulatus) 在幾個樣本數量較多的族群 (> 19 尾) 間就發現了些微 的遺傳分化，樣本數少的族群 (< 10 尾) 間則無，難以判斷這樣的族群遺傳結構是 真實情況或是採樣誤差所造成；第二，研究所選用的四種鯙類雖然棲位寬度不同，
但皆屬大型鯙類，成熟體長可達80 cm 以上 (羅，2009; Fishbase)，無法完全排除 大型個體具遷徙能力的可能性；第三，研究中雖然有利用耳石日輪數估算 PLD，
但每個物種只取兩個樣本進行分析，忽略了不同族群間可能因PLD 不同所造成遺 傳分化的可能性。
基於更周全的探討鯙類PLD 與族群遺傳結構間的關聯性，本研究採取以下策 略: (1) 增加各族群的樣本數量 (皆> 10 尾)，提供更可靠的族群遺傳資訊；(2) 以 屬小型鯙類且棲位寬度更為狹窄的小鰭鰭尾鯙作為目標魚種，可排除成體具遷徙 能力的可能性；(3) 以耳石估算每一尾樣本的 PLD，探討不同族群間的 PLD 是否
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有差異，若有差異性是否影響到族群遺傳結構。希望同時利用分子生物技術與耳 石微細結構的分析提供下列資訊:
(1) 東亞島弧地區小鰭鰭尾鯙的族群遺傳結構，探討 PLD 及生態棲位寬度對 族群間基因交流的影響。
(2) 探討東亞島弧地區小鰭鰭尾鯙的幼生成長階段是否有差異，以及可能的 影響因子。
(3) 分析臺灣週遭海域小鰭鰭尾鯙漂送及沉降模式，探討可能的影響因子。
(4) 建立臺灣地區小鰭鰭尾鯙的成長方程式，提供更多鯙類年齡成長資訊。
(5) 以小鰭鰭尾鯙作為代表性物種，提供未來相關鯙類保育與研究的參考資 料。
除上述主要目的外，本研究亦嘗試利用小鰭鰭尾鯙的漁業特性來探討其他議 題:漁業捕撈壓力對基因多樣性的影響。過度的漁撈開發容易造成生物多樣性及豐 度的減少，但某特定物種數量的減少是否會影響到基因多樣性的表現卻很少在海 洋魚類中被驗證 (Hauser et al., 2002)。小鰭鰭尾鯙屬低經濟價值的小型魚種，且只 分布在非常靠近沿岸的潮池中，相對不容易被混獲於現有漁法中，因此幾乎沒有 漁業捕撈上的壓力，適合作為對照組與其他相對漁業壓力大的鰻形目魚類比較，
探討漁業捕撈是否對物種的基因多型性造成影響，或有哪些其他可能因素亦會影 響，是本研究感興趣的議題之一。
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貳、材料方法
2.1 野外樣本採集
2.1.1 樣本來源
小鰭鰭尾鯙如同其他鯙科魚類，生殖季節從水溫回暖的 5 月開始，到 8 月份 為止為高峰期 (羅，2009)，在生殖季節期間，其活動力旺盛、索食欲望強烈，且 較不畏懼人為活動，而其他水溫較低的月份，則較不易發現小鰭鰭尾鯙的蹤跡。
因此於2014 年 7 月至 2015 年 8 月期間，於繁殖季時至臺灣本島各地可能有小鰭 鰭尾鯙出沒的地點進行調查，並在2015 年 2 月及 8 月期間，分別到日本石垣島及 菲律賓宿霧採集樣本 (圖一)。另一方面，亦從日本九州大學獲得部分琉球群島的 樣本，採樣詳細資料如 (表一)。
2.1.2 野外採集方法
日間或夜間退潮時，於淺灘或潮池中散佈誘餌，以腥味較重的餌食為主，如 俗稱炸彈魚的鯖科魚類或頭足類的透抽等，並觀察該區域是否有小鰭鰭尾鯙出沒。
若發現小鰭鰭尾鯙離開洞穴索餌，便以手抄網將其捕獲；若只有從洞穴或石縫中 伸出頭部探索，則以釣具組鉤著餌食放置於洞口前，待小鰭鰭尾鯙上鉤後，與其 拉扯消耗體力，莫約三到五分鐘便能將其拉出洞穴。採樣的期間同時以數位單眼 相機拍攝記錄環境照片。
2.1.3 樣本處理
捕獲的小鰭鰭尾鯙會先以活體的方式保存，回到實驗室後，將小鰭鰭尾鯙連 同海水放入- 20 °C 的冰箱中，如此做法可避免其因受到太大的刺激進而體表分泌 大量黏液，可能會造成重量測量上的誤差。
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所有樣本會先參考臺灣魚類誌 (沈等，1993) 及 Fishes of Japan (Nakabo, 2002) 的外觀形質特徵，並和臺灣魚類資料庫及 Fishbase 的照片比對，確定種類鑑定無 誤後，以數位單眼相機拍攝記錄魚隻外觀形質建檔 (圖二)。測量體長精確至 0.1 cm，
濕重精確至 0.01 g 後，將樣本以防水標籤標記編號，取出三對耳石中最大的矢狀 石 (Sagitta) 及一小塊背部肌肉組織，最後將樣本凍藏於- 20 °C 冰箱中保存。
2.2 分子生物實驗
2.2.1 DNA 萃取
使用Qiagen 公司的藥品，萃取步驟如下：
(1) 將少量肌肉組織加入 300 μl 之 Cell Lysis Solution 中，以燒烤過的解剖剪 刀將組織剪成小碎塊。
(2) 加入 Proteinase K 5 μl，置於恆溫器 55 °C 反應隔夜。
(3) 待組織分解至無塊狀，加入 Protein Precipitation Solution 100 μl，上下輕晃 使溶液混合均勻後作用10 分鐘。
(4) 以 13000 rpm，4 °C 離心 5 分鐘後將蛋白質分離，取上清液至新的 1.5 ml 離心管中。
(5) 加入等同 Cell Lysis Solution 體積的異丙醇 (Isopropanol)，上下輕晃使溶 液混合均勻，置於4 °C 作用 30 分鐘以上促使 DNA 沉澱。
(6) 以 13000 rpm，4 °C 離心 3 分鐘，去除上層液留下底部的 DNA 產物。
(7) 加入 70 %乙醇 500 μl 清洗，作用 10 分鐘。
(8) 以 13000 rpm，4 °C 離心 1 – 3 分鐘，去除所有乙醇並放置於恆溫器上，
以55 °C 加熱 1 個小時以上將剩餘乙醇烘乾。
(9) 加入 30 μl 之 dd H2O 將純化的 DNA 溶解，並以 55 °C 加熱 1 小時以上。
(10) 將所得的 DNA Solution 保存在- 20 °C 冰箱。
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2.2.2 PCR 聚合酶鏈鎖反應
萃取的 DNA 以 PCR 對於 Mitochondrial DNA 中的 cytochrome b (cyt b) 及 cytochrome c oxidase subunit I (COI) 片段增幅以供定序使用 (附錄一)。
(1) 所使用的引子如下:
(a) cyt b (增幅片段長度修正後為 680 bp):
L14725: 5’ -GTG ACT TGA AAA ACC ACC GTT G- 3’
(Song et al., 1998) H15573: 5’ -AAT AGG AAG TAT CAT TCG GGT TTG ATG- 3’
(Taberlet et al., 1992) (b) COI (增幅片段長度修正後為 656 bp):
FishF2: 5’ -TCG ACT AAT CAT AAA GAT ATC GGC AC- 3’
FishR2: 5’ -ACT TCA GGG TGA CCG AAG AAT CAG AA- 3’
(Ward et al., 2005) (2) PCR 反應條件:
PCR 所使用的藥劑為 TaKaRa 的 taq 套裝 kit 組，反應條件如下:
(a) cyt b 的總反應體積 75 μl，內容為 9 μl 之 10 × buffer、6 μl 之 dNTPs、
各6 μl 之 Primer (10 μM)、0.36 μl 之 ex taq 以及 9 μl 之 DNA (50 ng / μl)，
並加入38.64 μl 之 dd H2O 將總體積補至 75 μl。
(b) COI 的總反應體積 50 μl，內容為 6 μl 之 10 × buffer、4 μl 之 dNTPs、
各4 μl 之 Primer (10 μM)、0.25 μl 之 ex taq 以及 6 μl 之 DNA (50 ng / μl)，
並加入25.75 μl 之 dd H2O 將總體積補至 50 μl。
(c) PCR 的反應步驟為:
(i) 94 °C 下反應 5 分鐘使 DNA 雙股分離。
(ii) 接下來為 37 次的增幅循環，94 °C 下之 denature 1 分鐘、
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annealing temperature 47 °C (cyt b) / 50 °C (COI) 45 秒、72 °C 下 之extension 1 分鐘。
(iii) 72 °C 延伸反應作用 10 分鐘，使延伸反應完全。
(iv) 4 °C 暫存，待電泳確認 PCR 產物。
2.2.3 電泳染色
(1) 電泳凝膠製作 (1 %):
(a) 將 0.5 g 之 agarose 加入 50 ml 之 1 × TAE buffer 中。
(b) 使用微波爐加熱 2 分鐘，使 agarose 完全溶解。
(c) 將 2.5 μl 之 HealthviewTM Nucleic Acid Stain 染劑加入並攪拌均勻。
(d) 將液態膠灌入模板中，避光冷卻 40 – 50 分鐘。
(2) Loading sample:
(a) 分別取 5 μl 及 4 μl 之 PCR 產物和 DNA Ladder (100 bp)，各別與約 1 μl 之6 × Loading buffer 混合均勻，並將之填入膠中。
(b) 電泳槽反應條件為，135 V，24 分鐘。
(c) 將電泳凝膠取出放置於照相台上，以紫外光觀察並照相記錄產物。
成功增幅的PCR 產物，其應呈現單一明顯的亮帶。
2.2.4 DNA 純化定序
使用MACHEREY-NAGEL (http://www.mn-net.com/) 之 kit 進行純化，步驟如 下:
(1) 先將 PCR 產物之體積以 dd H2O 補足至 100 μl。
(2) 將 NTI buffer 加入 dd H2O 以體積 1 : 7 的比例稀釋，此步驟的目的是用來 去除非目標產物的小片段產物，使往後的定序能得到更乾淨的序列資
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訊。
(3) 將 100 μl 之 PCR 產物與 200 μl 稀釋過後之 NTI 混合，並移入 Clean – up Column 中。
(4) 以 11000 rpm 離心 1 分鐘，倒掉 collection tube 中的廢液。
(5) 加入 700 μl 之 NT 3 buffer，以 11000 rpm 離心 1 分鐘。
(6) 倒掉 collection tube 中的廢液，重複步驟 (5) 一次。
(7) 倒掉 collection tube 中的廢液後，再以 11000 rpm 離心 2 分鐘。
(8) 將 NE buffer 以每管 30 μl 的體積量先預熱到 70 °C。
(9) 捨棄下層 collection tube，將離心過後的上層 Column 置於新的 1.5 ml eppendorf 上，打開蓋子並置於恆溫器上約 10 – 15 分鐘 (70 °C)，為了將 NT 3 buffer 完全去除。
(10) 每管加入 30 μl 預熱好的 NE buffer，將蓋子緊閉後，繼續放置 70 °C 的恆 溫器上約10 – 15 分鐘，回溶產物。
(11) 以 11000 rpm 離心 2 分鐘，下層 1.5 ml eppendorf 中即為純化好之 PCR 產 物。
純化過後之PCR 產物會以 nanodrop 測量產物濃度，500 – 1000 bp 產物所需的 定序濃度範圍為20 – 50 ng / μl，而吸光值 260 / 280 則是介於 1.8 – 2.0 之間。確認 產物濃度及吸光值在合理範圍內後，將產物與引子分裝並送往國立臺灣大學生物 技術研究中心之核酸定序實驗室進行定序，其所使用的系統為ABI 3730。為了得 到較長及品質較好的序列片段，所有序列皆採雙股定序。
2.3 序列資料分析
2.3.1 序列整理與物種鑑定
定序完成後的原始序列，先以DNAStar ver. 7.1 中的 SeqMan 及 Editseq 手動將
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雙股序列整理合併並 align，alignment 完成的序列存成 MEGA ver. 6.0 軟體 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0; Tamura et al., 2013) 可讀取之 格式，並以之開啟，因為 cyt b 及 COI 全段皆為蛋白質轉譯基因 (protein - coding gene)，將核苷酸序列轉換為胺基酸序列，觀察是否有終止密碼子出現 (stop codon)，
確保定序的正確性。
為確保所有樣本皆無物種鑑定錯誤的情況發生，從線上基因資料庫NCBI 下載 鯙科內不同亞科及不同屬物種之 COI 序列，將本研究所定序之小鰭鰭尾鯙 COI 序 列加入，並以蛇鰻科物種的序列作為外群，以類聚分析法 (Neighbor – joining, NJ;
Saitou and Nei, 1987) 建構親緣關係樹，所用來計算鹼基替代率與遺傳距離的 model 為 Kimura 之雙參數模式 (Kimura's two-parameter, K2P; Kimura, 1980)，並以 Bootstrap 重複 1000 次計算樹形信賴度之檢測，其數值≧ 85 時代表強的支持度，
介於75 – 85 間代表中等的支持度，所使用的軟體為 MEGA ver. 6.0。除物種鑑定是 使用 COI 外，往後的分析皆以 cyt b 串聯 COI 作為分子標記。
2.3.2 親緣關係之重建
(1) 最大似然樹 (Maximum likelihood tree, ML tree)
Maximum likelihood 法需要三要素來計算: (1) 序列演化之模型 (model of sequence evolution); (2) 具分枝長度的樹狀拓樸 (tree topology with branch lengths); (3) 觀察到序列的性質 (observed character)。將序列排序好後，每一 個位點 (position) 皆視為一個單元，可計算其所有可能變化似然率的總和，便 可得到似然率總和最大的組合；而分枝長度的最大似然率則是利用 General time reversible (GTR) model 來計算，其設定除核苷酸出現頻率不同外，不同核 苷酸間替換的頻率也皆不同；最大似然率的序列演化模式，則是計算不同核 苷酸替換 / 顛換率 (transition / transversion ratio) 的比例下之似然率數值，便 可選定最大似然率之演化模型。ML tree 的建構同樣以 MEGA ver. 6.0 完成，
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並以Bootstrap 重複 1000 次計算樹形信賴度之檢測。
(2) 最小關聯網狀圖 (Minimum spanning network, MSN)
先以Arlequin ver. 3.5.1.2 ( Excoffier and Lischer, 2010) 計算出兩兩單倍型 間的距離，再使用HapStar ver. 0.7 (Teacher and Griffiths, 2011) 軟體建構最小 關聯網狀圖，將近源的單倍型彼此連接，若兩單倍型間差異過大，則以空心 圓代表「假設沒採集到之中間單倍型」，將兩單倍型連接。藉網狀圖便可觀察 各單倍型間的關聯性，以及找出較原始及衍伸的單倍型，另可結合單倍型在 地理位置上的分布，探討地理位置是否和單倍型分布有關聯性。
2.3.3 族群遺傳結構分析 (1) 序列多型性分析
利 用 DnaSP ver. 5.0 (Librado and Rozas, 2009) 計 算 單 倍 型 歧 異 度 (Haplotype diversity, h) 及核苷酸歧異度 (Nucleotide diversity, π) (Nei, 1987)。
單倍型歧異度是用於估計任意由族群中挑選兩相異樣本，其單倍型發生 不同的機率，只考慮各單倍型所出現的頻度，其公式如下:
h = − 1 1 −
式中，n 為總樣本數；Xi為單倍型i 所出現的頻度；m 為單倍型的數目。
核苷酸歧異度除考量各單倍型出現的頻度外，進一步考量序列間核苷 酸組成的差異程度，其公式如下:
π = − 1
式中，n 為總樣本數；Xi為單倍型i 所出現的頻度；Xj為單倍型j 所出現的頻 度；πij為單倍型i 和單倍型 j 序列間的核苷酸差異。
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此外，Grant and Bowen (1998) 提出可依據核苷酸歧異度 (π) 及單倍型歧 異度 (h) 之高低不同的組合，用以推估可能的族群變動歷史。
(2) 遺傳分化程度
利用Arlequin ver. 3.5.1.2 計算兩兩族群間之遺傳分化指數 (ΦST; Excoffier et al., 1992)，除考慮單倍型出現頻度外，亦考慮兩兩序列間的差異程度，使用 K2P model (Kimura, 1980) 計算序列間的遺傳距離，並以 p – value 表示經 1000 次 permutations 後 ΦST值是否接受基因同質性的虛無假設 (null hypothesis of genetic homogeneity)。
再以DnaSP ver. 5.0 計算兩兩族群間之基因流傳值 (Nm)，Nm 係由遺傳分 化指數 (FST; Hudson et al., 1992) 所推導而得。公式如下:
= 1 −
式中，Hw為相同族群內序列變異之平均值；Hb為不同族群間序列變異之平均 值。將FST帶入下列公式便可得到Nm (單套型基因適用):
Nm = 1 − 1 2
式中，N 代表族群大小；m 代表每一代移入個體的基因型比例。
當 Nm 值大於 1 時表示基因交流順暢，且足以使族群遺傳結構均質化，
抵消族群間因天擇及遺傳漂變所致的族群分化；反之，若Nm 值小於 1，則表 示基因流傳受到部分阻礙 (Maruyama and Nei, 1981; Slatkin, 1987)。
(3) 分子變異分析 (AMOVA)
將各族群依照不同方式分群後，以Arlequin ver. 3.5.1.2 進行分子變異分析 (analysis of molecular variance, AMOVA)，計算三不同層級的遺傳分化指數: (1) 不同地理區間 (ΦCT)；(2) 同地理區內不同族群間 (ΦSC)；(3) 族群內 (ΦST)。
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分子變異分析檢測進行 1000 次的 permutations，並計算有多少的變異比率發 生在各層級內。
2.3.4 族群歷史動態 (1) 中性檢定
中性假說的基礎理論為，族群中的遺傳變異大部分是受到隨機的基因漂 變 (gene drift) 所影響，而非來自於天擇的作用，因此核苷酸的變異程度僅受 到突變率的快慢所影響，演化較快的基因自然擁有較多的遺傳變異 (Kimura, 1983)。利用 DnaSP ver. 5.0 計算 Tajima’s D 及 Fu’ Fs 值，並以 Arlequin ver. 3.5.1.2 計算p – value，可得知其是否接受族群大小穩定的虛無假設 (null hypothesis of constant population size)。
根據理論，若Tajima’s D 及 Fu’ Fs 值為零時，表示此 locus 符合中性假說，
且沒有族群大小變動的證據；若其為正值，表示此 locus 可能受到平衡選擇 (balancing selection)，或族群可能受到近期瓶頸效應 (recent bottleneck effect) 影響，意即族群大小縮減；若其為負值，表示此 locus 可能受到定向選擇 (directional selection)、族群大小穩定成長或族群歷經瓶頸效應後的快速擴張。
此外，相較於Tajima’s D，使用 Fu’ Fs 值來偵測族群歷史波動能夠得到更 精確的結果 (Fu and Li, 1993)。
(2) 族群變異分布檢測 (mismatch distribution)
以 DnaSP ver. 5.0 計算兩兩個體序列間相差了多少個核苷酸 (pairwise difference)，並把全部個體比較後的結果繪製成核苷酸差異個數頻率的分布圖。
若在近期曾發生族群數量或地理分布的擴張事件，族群內快速累積大量差異 小的單倍型，使圖形呈現卜瓦松 (Poisson) 的單峰分布 (unimodal distribution)；
若呈現多峰分布 (multimodal distribution)，則代表族群數量穩定發展、不同變
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異 量 的 單 倍 型 分 布 均 勻 ， 或 是 族 群 內 呈 現 明 顯 的 遺 傳 分 化 (Rogers and Harpending, 1992)。
同時，以Arlequin ver. 3.5.1.2 計算 sum of squared deviations (SSD)，檢定觀測 值分布和以族群擴張模型建立的期望值曲線有無顯著差異 (Ramos-Onsins and Rozas, 2002)；並計算 Harpending’s raggedness index (HRI; Harpending, 1994) 表示 曲線的平滑程度，HRI 值越小代表曲線越平滑。當 SSD 與 HRI 在統計上皆不顯著 時，表示族群呈現擴張狀態。
2.4 耳石樣本製備
2.4.1 耳石取得及前置處理
由樣本腦顱和脊椎相連處開始，用解剖剪刀往吻端方向將頭骨剪開，以鑷子 將腦部組織移除並以清水清洗腦顱，再用鑷子將位於腦部下方溝槽內之矢狀石 (Sagitta) 取出。將取出的耳石置入內有蒸餾水的培養皿中，在光學顯微鏡下以鑷 子配合擦手紙剔除黏附於耳石上殘留的組織後，將耳石放入1.5 ml 之離心管中，
並置入烘箱 (50 °C) 中隔夜乾燥，最後保存於室溫當中。
統一取左側的矢狀石，以耳石溝槽 (sulcus acusticus) 朝下的方式置入包埋板 中，將環氧樹脂 (Epofix Resin) 和硬化劑 (Hardener) 以體積 15 : 2 攪拌混合均勻，
放入抽風櫃中五分鐘抽除微小氣泡後倒入包埋板中，在光學顯微鏡下以鑷子移除 黏附在耳石上的氣泡，置入烘箱 (50 °C) 中烘烤 1 – 2 小時使其固化後，利用慢速 切割機 (Isomet, Buehler, USA) 切除多餘的樹脂，並以熱熔膠固定於載玻片上，以 利往後研磨分析之用。
2.4.2 耳石研磨
耳石樣本以轉盤式研磨機 (Metaserv2000, Buehler, USA) 進行研磨，以 2400
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及2000 號砂紙，轉速 200 – 350 rpm 進行研磨，配以高解析數位相機 (Olympus DP71) 連接光學顯微鏡 (Olympus BX51) 進行觀察與拍照記錄，並配合表面光與穿透光 交互切換觀察研磨情況，直到核心部分輪紋清楚或核心凹槽出現於表面為止。改 以絨布上加上0.05 μm 氧化鋁粉混合溶液將耳石拋光，確認樣本表面平滑且無氧化 鋁粉殘留後，以5 % EDTA 腐蝕 60 – 100 秒加深輪紋，此時在表面光下可見明顯之 明暗帶交錯的年輪結構 (圖十八)，以表面光及穿透光分別拍照存檔。重複拋光的 步驟，以高倍率之穿透光拍攝耳石核心附近的微細結構後，將耳石保存於室溫中。
2.4.3 耳石鍶鈣比分析
在過去有關幾種鰻形目魚類變態的研究顯示，在狹首幼生開始變態時，其輪 寬會從最窄處明顯變寬，同時伴隨鍶鈣比由最高點急速下降，許多篇研究都將此 特徵視為開始變態的記號 (Marui et al., 2001; Correia et al., 2003; Correia et al., 2004)。因此，為了更加精確的定義耳石核心部分微細結構所代表的意義，勢必需 要輔以鍶鈣比的時序變化加以配合。
挑選了15 顆已研磨至核心的耳石進行鍶鈣比分析，首先，先確認拋光後的耳 石表面平滑無殘留之氧化鋁粉或灰塵，接著將耳石放入抽真空的烘箱中以80 – 90
°C 烘烤數天，並不時取出以顯微鏡檢查是否有水漬殘留於耳石表面。確認樣本狀 況後，將耳石從載玻片上取下，以碳膠帶固定於圓形玻璃載台上，送至中央研究 院地球科學研究所之電子微探分析儀實驗室進行分析。樣本表面會先鍍上一層碳 膜增加導電度，接著放入電子微探分析儀 (W-EPMA: JXA8900-R) 中，分析條件 電壓15 kV，電流 3 nA，每個分析點為 5 x 4 μm2，從核心開始沿最長穿越線分析 至耳石邊緣，分析各點中心點的距離為10 μm。與標準品比較後，可得知氧化鍶與 氧化鈣的重量百分比 (wt %)，再以氧化物換算後，便可得到鍶元素 (Sr) 及鈣元素 (Ca) 的重量百分比，只要將鍶除以鈣便可以得到各分析點的 Sr / Ca (wt %) 數值。
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2.5 耳石數據及年齡成長分析
2.5.1 日輪判讀
早期生活史日齡的沉積，在過去許多鰻形目鰻鱺科的魚類中已被證實，無論 是野生溫帶種類 (Tsukamoto, 1989; Martin, 1995; Cieri and McCleave, 2001)、熱帶種 類 (Arai et al., 2000a; Sugeha et al., 2001)，或是人工飼養實驗 (Umezawa et al., 1989;
Shinoda et al., 2004) 皆有報告，鰻魚初期生活史的日齡計算也已經普遍應用在不同 的物種上，因此本研究沿用此結果，假設小鰭鰭尾鯙早期生活史耳石之沉積亦是 一天形成一輪。
耳石日週輪的形成過程中，是由白晝時成長快速的連續帶與夜晚時成長較慢 的不連續帶所組成，在穿透光下，連續帶明亮，不連續帶則呈現深色，而一圈日 週輪的定義是包含一輪明亮的連續帶與一圈深色的不連續帶。計算從 FFC (first feeding check) 到不同記號位置的日輪數目 (圖九)，TMC、TGC及TMG (dsys)。圖中，
MC (metamorphosis check) 代表輪寬從最窄處開始變寬前的最後一輪；GC (growth check) 代表 MC 後之一深刻記號，記號外之輪紋結構忽然以倍數急遽增加，甚至 模糊不清；而MG 則代表 MC 與 GC 之間輪寬微增加之區域。耳石日輪數目以 SAS 套裝軟體 (learning edition 4.1) 進行 one – way ANOVA 檢定是否有顯著差異，並以 Duncan's multiple range test 進行事後檢定。
2.5.2 日輪輪寬及平均耳石成長率計算
以影像分析軟體 (ImageJ®)，統一沿最長軸 (anterior) 計算從 FFC 到 GC 間每 輪的輪寬 (increment width)，同一標本以每三輪做一平均輪寬，並繪製成圖表以觀 察輪寬的時序變化。同時測量從FFC 到 MC、GC，以及 MG 的距離 (圖九)，RMC、 RGC及 RMG (μm)。再以此距離除以相對應之日輪天數，便可得到平均耳石成長率 (average otolith growth rate)，GMC、GGC及GMG，其單位為μm / day ( e.g., RGC / TGC
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= GGC)。平均耳石成長率之統計檢定方法與日齡相同。
2.5.3 年輪判讀
雖然過去沒有關於小鰭鰭尾鯙年輪形成有效性驗證的文章，但張 (2009) 對臺 灣地區同為鯙科魚類的雲紋裸胸鯙 (Gymnothorax chilospilus) 進行耳石邊緣成長 率 (marginal increment ratio, MIR) 分析，發現年輪為一年形成一輪，且形成的高峰 位於10 – 1 月間； Matić-Skoko et al. (2011) 對地中海的澤生鯙 (Muraena helena) 進行MIR 分析，也得到了相似的結果。因此，本研究假設小鰭鰭尾鯙之年輪亦是 一年形成一輪，在顯微鏡下觀察5 % EDTA 腐蝕後的耳石，可見明顯之明帶與暗帶，
以暗帶之計算作為年齡的標準，並參考張 (2009)、ICES 2009 年對歐洲鰻鱺及美洲 鰻鱺年齡判讀之Workshop 及 Matić-Skoko et al. (2011) 之讀法，判讀小鰭鰭尾鯙之 年齡。在年齡的判讀上，以實際觀察到的耳石情況，配合捕捉月份、假設之出生 日與暗帶形成時間來估算年齡至月的精確度，詳細讀輪方法如 (圖二十) 所示。
2.5.4 體長體重關係式
將臺灣地區樣點小鰭鰭尾鯙測量所得之體長與體重資料，繪製成曲線圖並用 公式來描述之，如下:
BW = a TL
式中，a 與 b 是係數；BW 代表體重 (g)；TL 代表全長 (cm)。
2.5.5 年齡長度關係
根據臺灣地區耳石年輪判讀的結果對應全長資料，以每 2 公分為一間距，建 構小鰭鰭尾鯙之年齡長度關係，用以了解臺灣地區小鰭鰭尾鯙的年齡組成結構。
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2.5.6 成長方程式
將臺灣地區小鰭鰭尾鯙的年齡及全長帶入 von Bertalanffy growth equation (VBGE) 中，並以 R 進行非線性回歸得到另外三未知參數 k、t 0及L∞。VBGE 的 公式如下:
L = L 1 − e
式中，Lt為t 歲時的體長；L∞為理論之極限體長；k 為成長係數；t 0為體長為零時 之理論年齡。
2.5.7 讀輪精準度分析
所有耳石樣本在讀取前皆會以亂數重新排序，並給予新編號，年輪及日輪皆 判讀兩次以上，每次判讀至少間距兩個禮拜。若兩次判讀結果相符則採用結果；
若不相同，則按照前兩次的判讀結果，進行第三次判讀，並採用第三次的判讀結 果進行後續分析。
為了討論耳石讀輪的精準度，另計算平均百分誤差 (average percent error, APE;
Beamish and Fournier, 1981) 與變異係數 (coefficient of variation, CV; Campana, 2001) 加以評估，並繪製年齡別誤差圖 (age-bias plot; Campana, 2001)。APE 及 CV 的公式如下:
APE = 1 −
× 100%
CV =
∑ −
− 1 × 100%
式中，R 代表重複讀輪的次數；Xij代表在第 i 次判讀時，第 j 個樣本的輪數；Xj
代表j 個樣本在重複計算後之平均輪數。
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參、結果
3.1 樣本採集
於2014 年 7 月至 2015 年 8 月間自三個國家八個樣點共採集 176 尾小鰭鰭尾 鯙，詳細採集地點如下: (1) 菲律賓:宿霧巴迪安 (BD) 39 尾；(2) 臺灣:宜蘭大溪川 河口 (DX) 1 尾、花蓮石梯坪 (ST) 36 尾、臺東基翬 (JH) 32 尾、屏東車城黃金海 岸 (GC) 31 尾、萬里桐 (KT) 11 尾及小琉球 (LQ) 12 尾；(3) 日本:石垣島浦底灣 (IG) 由九州大學鹿野雄一教授協助採得 2 尾，另外相同採集地點由九州大學田和 篤史博士提供12 尾表本，共計 14 尾，採樣點詳細資料如 (圖一、表一) 所示。
野外採集的情況，小鰭鰭尾鯙的棲地環境相當多變，從珊瑚礁地形到散佈礫 石的淺灘皆可發現，但似乎特別偏好砂石底質的地形，通常發現的珊瑚礁地形底 質都會伴隨著許多礫石或粗顆粒的珊瑚沙 (圖三)，田 (2004) 在調查時亦發現，小 鰭鰭尾鯙能夠忍受較混濁、懸浮粒子多且具有許多廢棄物的水體，顯示其對環境 的適應能力較強。但無論哪一類的棲地，小鰭鰭尾鯙都喜愛棲息在高潮線到中潮 線附近，退潮時水深通常不會超過50 cm，有時甚至會暴露在空氣中，這種情況下 其似乎能夠鑽入富含水分的礫石或珊瑚沙中，避免在空氣中乾燥死亡。採集的過 程中，無論使用炸彈魚、透抽、南極蝦或新鮮魚肉，小鰭鰭尾鯙都會加以捕食，
但在農曆月初或月底新月時的活動力及食慾最旺盛，滿月時通常難以發現其蹤跡，
捕獲狀況都不盡理想，推測是和躲避視覺性掠食者有最大關聯。此外，常發現小 鰭鰭尾鯙和星帶蝮鯙 (Echidna nebulosa)、多環蝮鯙 (E. polyzona)、細點裸胸鯙 (Gymnothorax pictus) 、 黃 邊 鰭 裸 胸 鯙 (G. flavimarginatus) 、 花 鰭 裸 胸 鯙 (G.
fimbriatus) 及寬帶裸胸鯙 (G. rueppellii) 等鯙類之幼魚有共域的情況。
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3.2 分子生物實驗
3.2.1 物種鑑定
利用線上資料庫 NCBI 收集了八種鯙亞科 (Muraeninae)、五種鰭尾鯙亞科 (Uropterygiinae) 及兩種作為外群的蛇鰻科 (Ophichthidae) 物種之 COI 序列，共計 15 條序列。將自行定序的 176 條小鰭鰭尾鯙 COI 序列與上述網路序列一同利用類 聚分析法建構親緣關係樹 (NJ tree)。結果如 (圖四) 所示，鯙亞科及鰭尾鯙亞科的 序列皆各自成單系群 (monophyletic group) 並和外群分開，雖然線上資料庫查無小 鰭鰭尾鯙的 COI 序列，但自行定序的 176 條 COI 序列為單系群，且和關係最近的 兩個物種塞舌爾裸臀鯙 (Anarchias seychellensis) 及巨頭鰭尾鯙 (Uropterygius macrocephalus) 為姊妹群 (sister group)，Bootstrap 值達 99，支持物種鑑定結果的 正確性，所有樣本皆為小鰭鰭尾鯙，且其和塞舌爾裸臀鯙及巨頭鰭尾鯙的親緣關 係較近，因此往後小鰭鰭尾鯙種內親緣關係的探討將以巨頭鰭尾鯙作為外群分 析。
3.2.2 序列變異及多型性分析
總共定序了176 尾小鰭鰭尾鯙的兩粒腺體基因，分別為 680 bp 的 cyt b 基因及 656 bp 的 COI 基因序列，將兩基因串聯得到一長度為 1336 bp 之分子標記，此分 子標記經檢測後無任何插入 (insertion)、缺失 (deletion) 或停止碼 (stop codon)。
1336 bp 的序列中共有 175 個變異位點 (variable sites)、60 個單變異點 (singleton variable sites) 及 101 個簡約訊息位點 (parsimony informative sites)，176 條序列共 得到130 個單倍型 (haplotype)。核苷酸組成方面，A – T 及 G – C 的比例分別為 51.8
%及 48.2 %，個別比例為腺嘌呤 (adenine, A) 23.4 %、鳥糞嘌呤 (guanine, G) 17.8 %、
胸腺嘧啶 (thymine, T) 28.4 %及胞嘧啶 (cytosine, C) 30.4 %。
基因多型性方面如 (表二) 所示，全部樣本的單倍型歧異度 (Haplotype
