分析方法及項目

一、水質分析

依照實驗前、中、後三階段進行不同基質COD 濃度及不同混合配比之水質 分析，以利於探討本試驗在水解、酸化以及甲烷化三階段過程中，水質變化之 情形。

本試驗之水質監測項目為：化學需氧量(COD)、總固體物(TS)、懸浮固體 (SS)、鹼度(Alkalinity)及揮發酸(Volatile acid)。均以中華民國行政院環境保護署

之環境檢驗所公告之水質檢驗標準方法(NIEA) 操作之，唯揮發酸是採用 Albertson(1961)的直接滴定法來進行分析。

水質檢驗標準方法如下：

(1) 水中化學需氧量檢測方法－重鉻酸鉀迴流法(NIEA W515.53A)

(2) 水中總溶解固體及懸浮固體檢測方法－103~105℃乾燥(NIEA W210.57A) (3) 水中鹼度檢測方法－滴定法(NIEA W449.00B)

(4) 水中揮發酸檢測方法－Albertson(1961)直接滴定法

二、pH 值及氧化還原電位(ORP 值)

以pH meter、ORP meter(AI-ON MP-6100 pH meter)進行直接量測。

三、產氣量及氣體組成成份分析

以集氣設備(針筒)收集及記錄各試程之產氣量，再配合氣相層析儀(Gas Chromatograph：GC)進行甲烷、氫氣與二氧化碳成份之定量分析。

氣相層析儀操作條件如下(林明正，1999)：

1. Shimadzu GC-14A Gas Chromatograph(GC 主機) (1) Detector－TCD：100℃

(2) Carrier gas－N2：50 mL/min

(3) Column：2m×3.2mm ID*，max. temp.：150℃

(4) Stuff：HayeSep Q on 80/100 mesh (5) Temperature：

Injector 100 ℃ Oven 55 ℃ Detector 100 ℃

2. Shimadzu C-R6A Chromatograph(積分儀) (1) Width：5 sec

(2) Slope：65 µv (3) Min. Area：50 µv (4) Stop Time：4 min (5) Speed：5 mm/min

四、菌種之觀察

本 研 究 將 以 位 相 差 顯 微 鏡(Phase-Contrast Microscope) 、 螢 光 顯 微 鏡 (Fluorescence Microscopy)及掃描式電子顯微鏡(Scanning Electron Microscope, SEM)等三種進行二相式厭氧批次反應前、後期階段之生物菌相觀察，並以生物 菌種之形狀、大小與螢光發光顏色等判斷菌種於反應前、後期階段的差異變化；

並藉此觀察反應試程中醱酵產氫菌及甲烷菌存活的階段及對整體二相式厭氧反 應的影響。

位相差顯微鏡(Phase-Contrast Microscope)是指增加樣本之位相變化以利進 行觀察之方法，其原理為光波自物質通過後，使其原始速率再度減緩形成延遲 現象，這種延遲現象造成位相發生改變，可利用波長之分數(fraction of a wavelength)加以測量此位相變化之增加，產生不同位相之落後與吸收。而位相 差顯微鏡可以用來觀察活體微生物中內部之細微構造，且無須去固定或將樣本 染色即可觀察到微生物細胞內外部構造明顯的特徵。

螢光顯微鏡(Fluorescence Microscope)是利用螢光性的特點來觀察微生物發 光的情形，螢光性意指物質能夠吸收短波長的光(即紫外光)而放出波長較長的 光(可見光)的能力，而某些生物體在紫外光照射下可自然發出螢光，又稱自發 螢光(autofluorescence)(沈萍，2003；林良平，2002)。其原理為利用濾光片篩出 一特定波長之激發光，使從激發光源中獲得一螢光發射，並照射到樣本上，但 只有從激發光及螢光的混和光中篩選出來的螢光才能被眼睛所看到。

電 子 來 造 成 影 像 的 電 子 顯 微 鏡 ， 利 用檢 出 器 收 集 次 級 電 子 而 轉 換 為 訊 號 (signals)，幾經擴大後，形成影像(pixels)；不像光學顯微鏡是利用光的透射或反 射造成影像，也不像穿透式顯微鏡(Transmission electron microscope, TEM)是利 用電子線束穿透樣品造成影像(林良平，2002)。

而SEM 可被生物學家用來研究單獨細胞或整個細胞的立體形貌，藉由透鏡 的部分使可生成一個集中的電子束來掃描導電性樣本的表面，並使其產生許多 不同的訊號(signals)，其中樣本表面所產生的次級電子可經由收集、處理，最後 轉換成為陰極射線管和監視系統的影像(pixels)來觀察整體細菌之菌相。

(一) 以位相差顯微鏡與螢光顯微鏡觀察微生物菌相

於試程穩定狀態下，將三角錐瓶中之基質取出，在分別以位相差顯微鏡與 螢光顯微鏡觀察、照相。試驗步驟如下(林明瑞，1989)：

1. 將三角錐瓶中之樣品塗抹於載玻片上，蓋上蓋玻片。此時須注意抹上之生 物污泥不宜太厚，並避免留有過多水分，以減少在螢光顯微鏡觀察時所造成的 背景螢光干擾，因而影響菌相觀察。

2. 將樣品置於顯微鏡的樣品檯上，進行顯微鏡的觀察、照相。先進行螢光顯 微鏡的菌相觀察與照相，接著再轉換至位相差顯微鏡的狀態下，進行同一位置 的菌相觀察與照相。本研究中顯微鏡使用的放大倍率是 600 倍。在菌相觀察照 相中，使用的位相差與螢光顯微鏡為 Nikon ECLIPSE E600，操作條件為 Combination Name UV-2A, Dichroic Mirror 400, Barrier Filter 420。

(二) 以掃描式電子顯微鏡(SEM)觀察微生物菌相

於試程穩定狀態下，於三角錐瓶中取出樣品，以醋酸纖維濾紙過濾，使樣 品附著在濾紙上並截取一小片濾紙，經以下前處理步驟後，再以掃描式電子顯 微鏡觀察、照相。前處理之實驗步驟如下(林明瑞，1990)：

1. 將樣品滴上戊二醛固定液［以 0.1M 磷酸緩衝溶液(pH 7.0)稀釋 25％戊二醛

(Glutaraldehyde)溶液至 2.5％］，而後將樣品密封並置於4℃下進行固定 2.5 小時。

2. 隨後進行沖洗戊二醛固定液，將 0.1M 的磷酸鹽緩衝溶液連續沖洗樣品三 次，每次約10 分鐘。

3. 以不同濃度的酒精溶液，進行一系列樣本脫水作業。酒精的濃度變化依次 為 30、50、70、90、95、100、100、100％共計進行八次脫水每次均脫水 10 分鐘。

4. 以臨界點乾燥儀(Critical Point Dryer, CPD) JUMBO SERIES Ⅱ E3100，

進行臨界點乾燥。(委託操作)

5. 將樣品以雙面膠貼在樣品檯(stub)上，進行鍍金膜反應約 75 秒。(委託操作) 6. 以掃描式電子顯微鏡(TOPCON ABT 150S)觀察照相，加速電壓 15 kV，工

作距離15 cm。

五、數值分析分法

1. 等高線圖：將試驗所得到數據，利用數值分析軟體 3D Field 進行分析與模 擬，其分析方法為利用該軟體“simple contours”功能，將批次試驗各組數據 代入，即可求得等高線圖。

2. 動力學部分：Gompertz equation 為指數型的非線性方程式，因此利用數值 分析軟體 Sigma Plot V10.0 來進行參數迴歸求解，其方法為利用該軟體

“statistics”→“Dynamic Fit Wizard”功能，選取 Gompertz equation，將修正後 方程式輸入，並將批次試驗各組數據代入，即可求得遲滯期(λ)、產能潛勢 (P)、最大反應速率(Rm)等參數之解。