顯微鏡菌相觀察

本 研 究 將 以 位 相 差 顯 微 鏡(Phase-Contrast Microscope) 、 螢 光 顯 微 鏡 (Fluorescence Microscope)及掃描式電子顯微鏡(Scanning Electron Microscope, SEM)等三種進行二相式厭氧批次反應前、後期階段之生物菌相觀察，並以生物 菌種之形狀、大小與螢光發光顏色等判斷菌種於反應前、後期階段的差異變化；

並藉此觀察反應試程中醱酵產氫菌及甲烷菌存活的階段及對整體二相式厭氧反 應的影響。

根據Edwards & McBride(1975)的研究中發現，甲烷菌體會發出自發性螢光 (autofluorescence)，在螢光顯微鏡下以紫外光照射可發出淡藍色的螢光，藉此可 用來判斷甲烷菌是否存在及其生長狀況。又根據林明瑞、盧重興、邱毓明、賴 欣宏(2002)的研究指出，厭氧醱酵產氫反應具有較佳的產氫效率時，經由位相 差及螢光顯微鏡的觀察，其生物菌相以圓頭桿菌的 Clostridium 菌屬為主，且 Clostridium 菌屬會發出淡黃色的螢光；且又依 Fang and Tong Zhang(2006)的研 究，Clostridium butyricum 在螢光顯微鏡下亦呈現淡黃色之圓頭桿狀。

本次試驗所使用之位相差及螢光顯微鏡之接物鏡放大倍率為40 倍、接目鏡 為15 倍、因此總放大倍率為 600 倍；而在掃描式電子顯微鏡(SEM)方面則是以 放大1,000 及放大 3,000 倍率來觀察整體二相式厭氧反應之前期(醱酵產氫階段) 及後期(甲烷化階段)微生物菌相變化。

以下茲就分別以位相差、螢光及掃描式三種顯微鏡於各試驗反應前後階段 進行微生物菌相觀察的結果加以說明：其顯微鏡觀察樣本為採不同複合基質 COD 濃度(10,000、20,000、30,000 及 40,000 mg/L)其最佳產能之組別(基質 COD 濃度 10,000-30,000 mg/L 皆為＃5，其污泥/米糠＝1/4；基質 COD 濃度 40,000 mg/L 為＃4，其污泥/米糠＝2/3)作為觀察之樣本，並觀察各組別之二相式反應 階段(前段為醱酵產氫階段；後段為甲烷化階段)之菌相變化，其中包含微生物

菌相之特徵、大小、發光顏色、分佈情形等。

(一) 第一部份：位相差及螢光顯微鏡菌相觀察

此部分主要以位相差及螢光顯微鏡針對二相式厭氧反應前後階段(醱酵產 氫階段；甲烷化階段)進行微生物菌相觀察，在各不同基質 COD 濃度(10,000、

20,000、30,000 及 40,000 mg/L)下，以最佳污泥/米糠之產能組別及推估樣本微 生物之最佳生長時間（產氫階段依前次批次試驗結果約試驗第 2 天；而產甲烷 階段約為試驗第35 天）作為觀察樣本，並用來判斷產氫菌群(醱酵產氫階段)及 甲烷菌群(甲烷化階段)在各不同濃度下之生長優劣情形，如圖 4-16 至圖 4-23 所 示，其中圖(a)部分為位相差顯微鏡下所觀察之微生物菌相，而圖(b)部分則為將 位相差顯微鏡之同一觀察畫面切換至螢光顯微鏡下所呈現之微生物菌相變化。

(1) 二相式批次厭氧反應前段－醱酵產氫階段

圖 4-16(基質濃度為 10,000 mg/L 時、＃5 污泥/米糠=1/4)、圖 4-17(基質濃 度為20,000 mg/L 時、＃5 污泥/米糠=1/4)、圖 4-18(基質濃度為 30,000 mg/L 時、

＃5 污泥/米糠=1/4)及圖 4-19(基質濃度為 40,000 mg/L 時、＃4 污泥/米糠=2/3) 為厭氧生物反應前段部分即醱酵產氫階段，由圖 4-16 至圖 4-19 可明顯看出，

不管基質濃度為何，各濃度試驗在醱酵產氫階段主要之菌相以類似 Clostridium 圓頭桿菌之產氫菌為主。

由圖(a)部分可看出，在位相差顯微鏡觀察畫面中，Clostridium 圓頭桿菌其 分佈數量情形會隨著複合基質COD 濃度高低而有所變化，當基質 COD 濃度較 低(10,000 mg/L)，相對的污泥及米糠基質含量也相對較少，菌量較少(因試驗菌 種主要來源為基質)，微生物分佈也較為稀疏，而其中以 Clostridium 圓頭桿菌佔 大多數；相反的，隨著基質COD 濃度增加，污泥及米糠基質相對增多，微生物 其數量分佈也愈來愈密集，當基質COD 濃度在 40,000 mg/L 時，可看出微生物 不管其數量或其分佈情形都較為密集，且遍布整個觀察畫面，而在整個菌相，

仍舊以 Clostridium 圓頭桿菌佔大多數。

圖(b)的部份，主要藉由微生物在紫外光下所發出之螢光的特性來觀察菌種 種類及分佈狀況。由圖(a)及圖(b)互相比對可看出，在醱酵產氫階段主要以 Clostridium 菌為主呈圓頭桿狀且 Clostridium 會發出淡黃色螢光；在整個菌相觀 察中，除觀察到 Clostridium 菌外，又可看見複合基質(污泥＋米糠)裡含有各種 不同的菌，如發紅色螢光之光合菌以及發淡藍色螢光之甲烷菌等。

(2) 二相式批次厭氧反應後段－甲烷化階段

圖 4-20(基質濃度為 10,000 mg/L 時、＃5 污泥/米糠=1/4)、圖 4-21(基質濃 度為20,000 mg/L 時、＃5 污泥/米糠=1/4)、圖 4-22(基質濃度為 30,000 mg/L 時、

＃5 污泥/米糠=1/4)及圖 4-23(基質濃度為 40,000 mg/L 時、＃4 污泥/米糠=2/3) 為甲烷化反應階段之菌相，由圖 4-20 至圖 4-23 可明顯看出，長桿菌的甲烷菌 群為此階段之主要的優勢菌群。

而由圖(a)亦可觀察到甲烷菌之生長情形會隨基質 COD 濃度增加而其生長 也較為旺盛，因隨著基質COD 濃度增加，泥與米糠的基質含量也相對增加，污 泥與米糠可利用的基質也愈多，所以在後期甲烷化反應階段，甲烷菌生長的情 形也較好。

又由圖(b)螢光顯微鏡觀察可看出，後期甲烷化反應階段，甲烷菌生長過於 旺盛且為主要優勢菌種，呈淡藍色平頭狀。而在產氫反應階段中之優勢菌 Clostridium 圓頭桿菌已逐漸消失。

(二) 第二部份：掃描式電子顯微鏡(SEM)菌相觀察

第二部份主要是以掃描式電子顯微鏡(SEM)來進行菌相觀察，以瞭解二相 式厭氧反應中各階段(醱酵產氫階段為 Clostridium 菌，甲烷化階段為產甲烷菌)

第一部份：位相差及螢光顯微鏡菌相觀察圖

圖4-16 基質 COD 濃度為 10,000 mg/L、＃5(污泥/米糠=1/4)，前段(醱酵產氫階段) 之菌相觀察照片(放大倍率為 600 倍)

(a)位相差顯微鏡菌相觀察

米糠基質 污泥基質

(b)螢光顯微鏡菌相觀察圖

圖4-17 基質 COD 濃度為 20,000 mg/L、＃5(污泥/米糠=1/4)，前段(醱酵產氫階段) (a)位相差顯微鏡菌相觀察圖

(b)螢光顯微鏡菌相觀察圖 淡橘色螢光

圖4-18 基質 COD 濃度為 30,000 mg/L、＃5(污泥/米糠=1/4)，前段(醱酵產氫階段) 之菌相觀察照片(放大倍率為 600 倍)

(a)位相差顯微鏡菌相觀察圖

(b)螢光顯微鏡菌相觀察圖

圖4-19 基質 COD 濃度為 40,000 mg/L、＃4(污泥/米糠=2/3)，前段(醱酵產氫階段) (a)位相差顯微鏡菌相觀察圖

(b)螢光顯微鏡菌相觀察圖

圖4-20 基質 COD 濃度為 10,000 mg/L、＃5(污泥/米糠=1/4)，後段(甲烷化階段)之 菌相觀察照片(放大倍率為 600 倍)

(a)位相差顯微鏡菌相觀察圖

(b)螢光顯微鏡菌相觀察圖

圖4-21 基質 COD 濃度為 20,000 mg/L、＃5(污泥/米糠=1/4)，後段(甲烷化階段)之 (b)螢光顯微鏡菌相觀察圖

(a)位相差顯微鏡菌相觀察圖

圖4-22 基質 COD 濃度為 30,000 mg/L、＃5(污泥/米糠=1/4)，後段(甲烷化階段)之 菌相觀察照片(放大倍率為 600 倍)

(a)位相差顯微鏡菌相觀察圖

(b)螢光顯微鏡菌相觀察圖

圖4-23 基質 COD 濃度為 40,000 mg/L、＃4(污泥/米糠=2/3)，後段(甲烷化階段)之 (a)位相差顯微鏡菌相觀察圖

(b)螢光顯微鏡菌相觀察圖

在醱酵產氫階段，SEM 以 3,000 倍率來進行菌相觀察，而由圖 4-22(a)基質 COD 濃度為 10,000 mg/L 時＃5 污泥/米糠=1/4、(b)基質 COD 濃度為 20,000 mg/L 時＃5 污泥/米糠=1/4、(c)基質 COD 濃度為 30,000 mg/L 時＃5 污泥/米糠=1/4 及 (d)基質 COD 濃度為 40,000 mg/L 時＃4 污泥/米糠=2/3 中，可清楚看出圓頭桿菌 之 Clostridium 菌群分佈會隨著基質 COD 濃度的提升而有密度愈高的現象，與 位相差及螢光顯微鏡觀察現象相同，且 Clostridium 菌群之生長情形也較好，為 優勢菌群。

然而隨著微生物由前段厭氧醱酵反應階段進入後段甲烷化反應階段，由圖 4-23(a)基質 COD 濃度為 10,000 mg/L 時＃5 污泥/米糠=1/4、(b)基質 COD 濃度 為20,000 mg/L 時＃5 污泥/米糠=1/4、(c)基質 COD 濃度為 30,000 mg/L 時＃5 污泥/米糠=1/4 及(d)基質 COD 濃度為 40,000 mg/L 時＃4 污泥/米糠=2/3 中，由 圖可清楚看出，當基質COD 濃度較低(基質 COD 濃度為 10,000 mg/L)時，甲烷 菌生長密度較為稀疏且甲烷菌也較為瘦長，因此需以放大 3,000 倍之倍率來進 行觀察，才可明顯看出其生長狀況及特徵；然而當基質 COD 濃度逐漸提高至 20,000、30,000 及 40,000 mg/L 時，甲烷菌之生長情形則逐漸旺盛，由圖 4-24 之(b)、(c)、(d)便可看出，有部分甲烷菌已生長壯碩，因此必需以較小的放大倍 率(×1,000)才能明顯看出其整體生長情形，而在產氫反應階段中之優勢菌 Clostridium 圓頭桿菌已逐漸消失，幾乎不可見。

綜 合 上 述 ， 在 前 段 醱 酵 產 氫 階 段 中 ， 微 生 物 菌 相 以 淡 黃 色 圓 頭 桿 狀 Clostridium 菌為主，而在後段甲烷化反應階段中，微生物菌相則以從污泥中穿 出之淡藍色平頭長桿菌之甲烷菌(Methanosaeta)為主，因此可確定本研究試驗所 採用之二相式操作(前段為醱酵產氫階段；後段為產甲烷階段)，已達到預期效 果且可增加產能效率。

第二部份：掃描式電子顯微鏡菌相觀察圖

圖4-24 不同基質 COD 濃度下，前段(醱酵產氫階段)之 SEM 菌相觀察照片(放大倍 (a)基質 COD 濃度為 10,000 mg/L 之前段 SEM 觀察圖

(b)基質 COD 濃度為 20,000 mg/L 之前段 SEM 觀察圖

Clostridium

Clostridium

圖4-24 不同基質 COD 濃度下，前段(醱酵產氫階段)之 SEM 菌相觀察照片(續) (放 大倍率為3,000 倍)

(d)基質 COD 濃度為 40,000 mg/L 之前段 SEM 觀察圖 (c)基質 COD 濃度為 30,000 mg/L 之前段 SEM 觀察圖

Clostridium

Clostridium

圖4-25 不同基質 COD 濃度下，後段(醱酵產氫階段)之 SEM 菌相觀察照片(放大倍 率為3,000 倍及 1,000 倍)

(a)基質 COD 濃度為 10,000 mg/L 之後段 SEM 觀察圖

(b)基質 COD 濃度為 20,000 mg/L 之後段 SEM 觀察圖 甲烷菌

甲烷菌

圖4-25 不同基質 COD 濃度下，後段(醱酵產氫階段)之 SEM 菌相觀察照片(續) (放 大倍率為1,000 倍)

(c)基質 COD 濃度為 30,000 mg/L 之後段 SEM 觀察圖

(d)基質 COD 濃度為 40,000 mg/L 之後段 SEM 觀察圖 甲烷菌

球菌

甲烷菌