厭氧醱酵產氫及厭氧甲烷化反應機制

厭氧消化乃是指在厭氧條件下，藉著兼氧性及厭氧性微生物生化代謝作 用，將複雜之高分子有機物(如蛋白質、碳水化合物、脂質等)降解，轉換成甲 烷與二氧化碳等最終產物的程序。

就產氫反應機制而言，厭氧醱酵產氫是利用特殊微生物及酵素，在水體環 境中將複雜有機物水解酸化，分解出中間產物氫氣；而產甲烷反應機制則是以 甲烷菌利用其中間產物(氫氣等)經甲烷化反應而生成甲烷氣體。

傳統厭氧消化反應是在無氧的環境下，首先，由兼氧性及厭氧性細菌透過 水解、產酸的反應(即厭氧醱酵階段)，將廢水中有機物(如不溶性有機物質、碳 水化合物、脂肪或蛋白質等)轉化成揮發酸、氫氣、醇類或醛類等中間代謝產物 後；而這些中間代謝產物再轉化為甲烷及二氧化碳等最終穩定產物，其反應機 制如圖2-2 有機物之厭氧分解反應流程圖所示。

圖2-2 有機物之厭氧分解反應流程圖 低級有機物

細胞外酵素反應 廢水之有機物

酸生成菌

細菌細胞體 有機酸、CO2、H2 其他生成物

細菌細胞體 甲烷(CH4)、CO2

甲烷生成菌

厭氧醱酵反應

甲烷化反應

又由圖 2-3 傳統厭氧消化反應過程可看出，其反應最終產物為二氧化碳及

本節主要分成二個部分來探討厭氧微生物產能之機制：(一)厭氧醱酵產氫 反應及(二)厭氧甲烷化反應。

一、厭氧醱酵產氫反應

在傳統厭氧反應分解有機物的過程中，厭氧微生物群先將有機物經水解產 酸反應，將大部分有機物轉化為揮發酸、醇、醛、氫氣等中間代謝產物；若生 長條件適當，這些中間代謝產物又會被甲烷生成菌分解或轉換成甲烷。厭氧醱 酵產氫則是設法終止後面的甲烷化反應，仍持續進行前面的水解產酸反應以利 於氫氣的產生。由Das and Veziroğlu(2001)的研究指出厭氧醱酵產氫反應有非常 高的氫氣轉換率、穩定的氫氣產生量及良好的微生物生長率等優點，因此在微 生物共營狀況良好的系統中，電子、氫與能量在水解、酸化與甲烷化反應之間 傳遞著，氫氣很難被釋放至氣相之中，但是反應槽中微生物共營系統一旦失去 平衡，氫氣未被甲烷化反應快速消耗，則將會被釋放至氣相中。

Lay, Lee and Noike(1999)在有機廢污水醱酵產氫的研究中提到，目前連續式 進流產氫的效果並不佳，原因是氫氣會被甲烷轉換及消耗。(1)假如氫消耗者(如 甲烷菌)的活動能被抑制，例如：pH 過低(pH 介於 4.0-5.55 之間)，或(2)產生的 揮發酸量過多，對甲烷菌產生抑制或來不及被甲烷菌所分解，或(3)系統操作於 不穩定狀態，如經常變換有機負荷量等；厭氧生物產氫將極具潛力。由於有機 廢水在進行厭氧消化時在酸化階段會產生氫氣，而甲烷菌則是繼續利用氫氣及 二氧化碳產生甲烷氣。

在厭氧醱酵產氫機制方面，由於能量是微生物存活所必須的原動力，而微 生物細胞內能量的來源，主要來自可釋放能量的化學反應，故此能量為一種化 學能。此種化學能貯存在許多的化合物內，當分子分解時，可將貯存的能量釋 出( 楊 美 桂 ， 2003) 。 而 其 中 最 主 要 的 反 應 為 貯 能 化 合 物 為 腺 核 苷 三 磷 酸

ADP)而釋放出能量。

ATP 的 產 生 是 藉 由 三 種 磷 酸 化 的 作 用 (1) 光 合 磷 酸 化 作 用 (photo- phosphorylation)、(2)基質階層之磷酸化作用(substrate-level phosphorylation)、(3) 氧化磷酸化作用(oxidative phosphorylation)而產生的。其中，本研究之醱酵產氫 是以(2)基質階層之磷酸化作用來進行：是由代謝過程中所產生的高能量磷酸化 合 物 ， 直 接 將 能 量 轉 給 ADP 而 形 成 ATP ， 如 1,3 二 磷 酸 甘 油 酸 (1,3-diphosphoglyceric acid)的磷酸基給 ADP 而形成 ATP。厭氧醱酵微生物以此 法產生所有的能量，在醱酵作用中，葡萄糖轉化成丙酮酸，而丙酮酸再進一步 被各種微生物轉化成許多的副產物。

Girbal, Crox, Vasconcelos and Soucaille(1995) 提 出 Clostridium acetobutylicum 分解葡萄糖的厭氧醱酵路徑，如圖 2-3 所示。不同路徑所生成的 代謝產物也不一樣，包括 lactate、acetone、ethanol、butanol、butyrate、acetate 等。而最佳的厭氧產氫反應為產乙酸的反應途徑。又由圖 2-4 可看出，醣類轉 換到 pyruvate 的過程可產生 NADH，而 NADH 在 hydrogenase 及 ferredoxin 的 作用下轉回NAD^＋並釋出H2。在電子傳遞的過程中可發現，在產acetate 的路徑 上 NADH 不會被消耗，幾乎全部由 hydrogenase 及 ferredoxin 的作用而釋放出 H2。由電子的轉移、能量的轉換探討，微生物分解葡萄糖是傾向產生氫氣與乙 酸的途徑。所以葡萄糖及蔗糖是最常用來進行產氫研究的基質。理論上每莫耳 的葡萄糖可產生 4 莫耳的氫氣，此時乙酸是醱酵的副產物；當醱酵的副產物為 丁酸時，產氫量僅為產乙酸時的一半而已(Girbal et al., 1995)。

C6H12O6＋2H2O→2CH3COOH＋2CO2＋4H2 (2-3) C6H12O6＋2H2O→CH3CH2COOH＋2H2＋2CO2 (2-4)

(1)hydrogenase, (2)ferredoxin-NAD reductase, (3)NADH- ferredoxin reductase, (4)phosphotransacetylase, (5)acetate kinase, (6)phosphotransbutrylase, (7)butyrate kinase

圖2-4 厭氧醱酵路徑圖(Girbal et al., 1995)

由上述可知，一般傳統厭氧消化反應可分為三階段，即水解、酸化、及甲 烷化三階段。而厭氧醱酵產氫反應則發生在水解及酸化階段，以下就這二階段 進行討論。

1. 水解階段

此階段是利用細胞外水解酵素(extracellular enzymes)將複雜的有機物(如蛋 白質、脂肪、多醣類等)分解成簡單的化合物(如胺基酸、甘油、單醣等)，而水 解的效率受到pH 值、水力停留時間(Verstraete, de Baere & Rozzi, 1981)及基質種 類(Henze & Harremöes, 1983)等因素影響。

Gujer and Zehnder(1982)指出，若進流基質為一般性有機廢水，在水解階段 不易形成速率限制，但若進流基質含有芳香族類有機化合物、纖維素等難水解 物質時，在水解階段將成為反應速率限制步驟(Kennedy & van den Berg, 1982)。

2. 產酸階段

在此階段主要是將水解後的小分子有機物轉化為氫氣、二氧化碳及揮發性 脂肪酸，包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸及己酸等(McCarty, 1964)，產物之種類依細菌種類、反應條件(如基質、溫度、pH、氧化還丙酸、

丁酸)及醇類轉化成乙酸根、氫氣及二氧化碳等可直接被甲烷生成菌利用之化合 物。因高氫氣分壓時會抑制乙酸根之生成，而使基質大部分轉化為丙酸、丁酸、

乙醇，因此傳統厭氧消化必需監控氫氣之濃度。

在厭氧生物產氫代謝機制方面，Taguchi, Chang, Takiguchi and Morimoto (1992)以 Clostridium butyrium 為菌種，反應槽溫度控制在 36℃、pH 值控制在 5.5 的條件下操作，理想的產氧效率為 2.0-4.0 mole-H2/mole-Glucose，但實際產 氫效率大約只有理想產氫效率的60％。其產氫反應方程式如下所示：

C6H12O6→2H2＋butyrate＋2CO2 (2-5) C6H12O6＋2H2O→4H2＋acetate＋CO2 (2-6)

其中反應式(2-5)的產氫效率為 33％，反應式(2-6)的產氫效率為 67％，其比

值為 1：2，這說明了 Clostridium butyricum 如果能進一步將葡萄糖分解到乙酸 階段則其產氫量約為分解到丁酸階段的2 倍。

Lay, Lee and Nokie(1999)研究中指出，目前利用有機廢水進行醱酵產氫試驗 其效果並不佳，原因是氫氣會被甲烷轉換及消耗。因此如能將此階段控制在厭 氧產氫菌最佳生長條件的操作下，可大幅提昇厭氧產氫的效率，而目前常使用 的方法有：

(1)pＨ值控制於較酸的環境。

(2)完全混合反應培養。

(3)儘量將系統操作在醱酵產氫菌適合生長，而甲烷菌不適合生長的環境。

三、厭氧甲烷化反應

甲烷是全球性碳循環中相當稀少的成員元素，但因其為厭氧型細菌的代謝 產物之一，故也具有相當的微生物學意義。甲烷的產生是由一群高度特化的產 甲烷菌(methanogenic bacteria)所進行的，具有專性的厭氧菌。甲烷的產生代表 在自然界中無氧氣分解聚合物如纖維素、澱粉和蛋白質之眾多微生物所行複雜 反應的末端部分，甲烷產生菌如甲烷產生桿菌(Methano- bacterium)、甲烷產生 八聯球菌(Methanosarcina)等，其在無氧環境下能產生甲烷自營生活。

許多甲烷產生菌為絕對厭氧，短暫暴露空氣後都無法生存，因為甲烷產生 棲地相似於早期地球環境，所以可推測，甲烷產生菌應該是最古老的地球生物 之一。此外，多數甲烷產生菌還能利用簡單的有機物，如：甲酸、甲醇和醋酸 (acetate)等產生甲烷異營生活。其甲烷產生菌還原 CO2產生甲烷的循環模式如圖 2-5 (李銘亮，2002)。

圖2-5 甲烷產生菌還原 CO2產生甲烷的循環模型圖(李銘亮，2002)

在許多無氧的環境下，甲烷氣(CH4)直接的前身是氫氣(H2)與二氧化碳 (CO2)，是由醱酵性厭氧菌作用所產生的基質。對於典型多醣類(如纖維素)轉變 成甲烷的整個過程，共有五種主要的細菌生理群參與期間，其中溶纖維素細菌 (cellulolytic bacteria)會將高分子量的纖維素分解成纖維二糖(cellobiose)後再裂 解成游離性葡萄糖。葡萄糖接著由醱酵性無氧菌(fermentative anaerobes)醱酵成 各種醱酵性產物，其中以醋酸、丙酸、丁酸、氫氣與二氧化碳等最為常見；凡 是初次醱酵所產生的氫氣則立即會被產甲烷菌(methanogenic bacteria)所消耗。

將複雜的物質轉變成甲烷的主要細菌是產氫性脂肪酸氧化菌(H2- producing fatty acid-oxidizing)。這類菌體會利用脂肪酸或酒精作為能源，但在這些基質的 純培養中卻生長的很差，或根本就不生長。但若與耗氫性細菌(如產甲烷菌或硫 酸鹽還原菌)一起時，則生長的很旺盛，其原因，乃因氫的消耗對產氫性脂肪酸 氧化菌的生長非常重要之故(謝哲松譯，1995)。

厭氧甲烷化反應是指在厭氧環境系統中高分子有機物被厭氧微生物分解代 謝之過程，在此是指甲烷生成菌利用有機物在水解、酸化階段所產生之乙酸、

氫氣、二氧化碳及其他低碳化合物之中間產物，轉化成甲烷及二氧化碳等氣體 的過程(張鎮南等，2001)。

甲烷生成菌主要可區分為嗜氫(hydrogenotrophic)及嗜乙酸(ace- totrophic)甲 烷生成菌二個次族群，而嗜氫甲烷生成菌可將氫及二氧化碳轉化成甲烷；嗜乙 酸甲烷生成菌可將乙酸根轉化成甲烷及二氧化碳，其反應機制如下(第三節曾提 及之)，而其甲烷作用途徑如圖 2-6。

1. 嗜氫甲烷生成菌 CO2＋4H2 → CH4 (甲烷)＋2H2O (2-1) 2. 嗜乙酸甲烷生成菌 CH3COOH → CH4 (甲烷)＋CO2 (2-2)

許多研究指出，若能區分為「厭氧醱酵產氫」及「厭氧甲烷化反應來進行」， 即二相式厭氧反應，則會比單相式甲烷反應或厭氧產氫反應有較佳之產氫效 率。本研究將以二相式厭氧操作，分為前段pH 5.0-5.5 及後段 pH 7.0 進行批次 試驗之二相式厭氧反應操作。

圖2-6 主要甲烷化作用途徑(謝哲松譯，1995)

(a)從二氧化碳(CO2)開始之甲烷化途徑 (b)從乙酸(CH3COOH)開始之甲烷化途徑