動物實驗材料及方法

一、動物

1. 四週齡Sprague-Dawely(SD)品系雄鼠，體重300 ~ 350g，購自 臺大醫院動物中心。平時給予充足飼料及逆滲透去離子水任時任飲 (ad libitum)，動物房飼料條件溫度控制25±2℃，相對濕度範圍為55-70

％與12小時光/12小時暗之光照週期。

二、主要試劑

Sodium Citrate, Triton X-100, Hydrogen Chloride(HCL), Sodium phosphate Dibasic (Na₂HPO₄), Sodium Phosphate Monobasic (NaH₂PO₄), Sodium Chloride (NaCl), Streptozocin (STZ), 生理食鹽水,血糖試紙 , 0.1N Hydrogen Chloride(HCL), 10% Phospotungstic acid, Glucose

oxidase assay：RANDOX (Antrim, UK) , Ethyl ether, Glucose, Glycerol, Methanol

三、主要實驗儀器及耗材：

1. 毛細管玻璃(Chase)

2. 減壓濃縮機 (Rotavapor R200 Series, Buchi) 3. 冷凍乾燥機 (FreeZone 6, Labconco)

4. 離心機 (Hermle Z300)

5. 酵素免疫分析儀 (VERSAmax microplate reader，Molecular Devices)

6. 微量天平 (TB-214, Denver instrument) 7. 去離子水製造機 (Milli-Q, Millipore)

8. 酸鹼值測定計 (Microcomputer pH/mV/TEMP meter 6171) 9. 恆溫水浴槽 (Zeta ZC-4000, KS)

10. 震盪混合器 (Vortex-genie 2, Scientific industries) 11. Pipetment (Tipor-V, Orange scientific)

12. 96槽ELISA微量盤 (Greiner bio-one) 13. Pipet tips (Extra gene)

14. 包埋機(Beckman Counter)

四、實驗方法

(一)毒性實驗

概述某一種新藥，一個新的製劑，於臨床使用前，必須經過這個 步驟。雖然藥物對人的作用，不完全能在動物身上表現出來，但對一 個新藥物來說仍是一個很有用的參考資料。因此，為保證病人的用藥 安全，新藥在臨床應用前一定要進行毒性試驗。毒性試驗的類型，可 根據藥物的性質及使用途徑、方法和時間等加以選擇。如有的藥物後

則產生中毒症狀；有的藥物需長期服用才能奏效等。因此，藥物的毒 性試驗，應根據該藥物的特點來決定。

單一劑量口服急性毒性試驗經單一劑量餵食試驗物質後(包含24 小時內完成的多次餵食)，對哺乳類動物之急性毒性影響，包括檢測 其在體內毒理特性之量與質的任何改變。

口服單一毒性試驗（一般安全試驗）取健康小白鼠 10 隻，雄、

雌兩性各半，由口服10 g/Kg 的藥液後：

觀察：

(1)一般試驗觀察期為 14 天，每天觀察動物至少二次，以確定死亡情 形。

(2)每天觀察試驗動物的臨床症狀一次以上，記錄試驗動物顯示的毒 性症狀，包括死亡率、臨床毒性症狀(嚴重程度)、發生時間、持續 的時間及中毒後的復原性，並瞭解毒性症狀與劑量及時間的關係。

(3)在觀察期間死亡的動物及試驗終結存活的動物均須進行解剖和肉 眼病理檢查。

(4)若試驗需要，所有肉眼可觀察到有病變的器官與組織均須進行組 織病理檢驗。

(二)葡萄糖口服耐受性實驗( Oral Glucose Tolerance Test)

此實驗可簡單區別藥物是否有改善糖尿病的功效。受測試的動物

須經過12小時以上斷食，先測第一次的血中葡萄糖濃度然後再給予藥 物30分鐘後再測一次血中葡萄糖濃度，之後才給予一劑量的葡萄糖(1 g/kg, i.p.),以後每隔30分鐘測一次的血中葡萄糖濃度，直到血中葡萄糖 恢復至第一次血中葡萄糖濃度範圍。

(三)建立第二型糖尿病模式

參考Hemmings and Spafford等人的第二型糖尿病大白鼠誘導模 式加以修飾，分成兩階段誘導。注射程序先以腹腔注射 nicotinamide (15 mg/kg BW)，15 分鐘後再以腹腔注射streptozotocin (STZ)，分成 兩階段誘導。第一階段STZ 劑量為20 mg/kg BW，每天注射。一週後，

測禁食血糖值，當大白鼠禁食血糖值大於 130 mg/dL 認定為糖尿 病，整個糖尿病誘導期共需兩週的時間。

(四)實驗設計

實驗分為正常小白鼠及利用STZ 誘發成功的糖尿病鼠。正常鼠 設為正對照組，而糖尿病鼠隨機分為四組，分別為糖尿病組，和給予 低(0.1 g/kg)中(0.5 g/kg)高(1 g/kg)劑量的藥物，皆給予正常飲食。實驗 進行28天，每7天進行體重測量，和空腹抽血分兩管收集，一管不加 抗凝血劑採血後以3000 rpm離心五分鐘取得血清，另一血液收集管以 EDTA抗凝血劑潤濕採血後取得血漿，儲存於-20℃備用。血清用於檢

測血糖濃度，血漿則用於檢測HbA1c變化，持續飼養至第8週，進行 動物犧牲大體解剖取胰臟。

(五)血清中 Glucose、Triglycerides、Cholesterol、HDL(High density lipoprotein)與 LDL(Low density lipoprotein)濃度測定

每一樣品取血清0.2 mL 以血清生化分析儀(Express Plus

Automatic Clinical Chemistry Analyzer , Chiron Diagnostics, OH ,USA) 來檢測相關的血清生化值，依分析項目，使用商品化試劑(Glucose, Roche Diagnostics ),( Triglycerides, Roche Diagnostics) ,( Cholesterol, Roche Diagnostics) ,( HDL, Roche Diagnostics) , ( LDL, Roche

Diagnostics) 。

(六)胰臟 β-cell 免疫化學染色(immunohistochemistry)分析

使用商品化IHC Select(Chemicon)分析套組，胰臟組織經中性福 馬林溶液固定後，進行石蠟包埋程序，後以切片機(Microtome)切片並 展片於事先以Coating 上 Poly-L-Lysine solution 載玻片上，並加入 Citrate buffer 微波兩分鐘，微波三次以去除組織所浸潤的石蠟，使預 增偵測之抗原暴露出來，避免組織乾燥，如微波過程Buffer 須隨時補 充。玻片以 3％H2O2處理，以減少背景干擾，並加上 Protein blocking

agent 10 分鐘以抑制任何蛋白質與標本之非專一性結合，後加入稀釋 1000 倍的特異性胰島素 Mouse 單株抗體(Abcam,Cat. No.ab6995)反應 2 小時，後加入以接上反應酵素而不具特異性二次抗體反應 45 分鐘，

後加入Streptavidin-peroxidase 以酵素標定免疫複合物，最後藉由呈色 劑呈色30 分鐘，另外加入 Hematoxylin 以做為背景染色，之後洗淨 封片，即可以顯微鏡觀察結果。