抗氧化實驗方法

圖二十二、臺灣天仙果四種部位植物抗氧化實驗架構圖

一、主要化學試劑：

台灣產臺灣天仙果植物四個 部位根、莖、果實、葉子

醛糖還原酶抑制、α-葡 萄糖苷酶抑制之研究

Butylate hydroxyltoluene (BHT), glutathione reduced form (GSH), potassium peroxodisulfate (K₂S₂O₈), 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), Tris (hydroxylmethyl) aminomethane, potassium ferricyanide (K3Fe(CN)6), trichloroacetic acid (TCA), ferric chloride (FeCl3), (+)-catechin, aluminum chloride hexahydrate (AlCl3·6H2O), rutin, 2,2’-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline)-6-sulphonic acid (ABTS), sodium bicarbonate (Na₂CO₃), sodium phosphate dibasic (Na₂HPO₄), sodium phosphate monobasic (NaH2PO4), p-dimethylaminocinnamaldehyde (DMACA)及其他試劑，皆購自 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)。 Folin-Ciocalteu solution 及 95% ethanol 則購自 Merck Co.

(Santa Ana, CA, USA)。

二、主要實驗儀器及耗材：

1. 減壓濃縮機 (Rotavapor R200 Series, Buchi) 2. 冷凍乾燥機 (FreeZone 6, Labconco)

3. 離心機 (Hermle Z300)

4. 酵素免疫分析儀 (VERSAmax microplate reader, Molecular Devices)

5. 微量天平 (TB-214, Denver instrument) 6. 去離子水製造機 (Milli-Q, Millipore)

7. 酸鹼值測定計 (Microcomputer pH/mV/TEMP meter 6171) 8. 恆溫水浴槽 (Zeta ZC-4000, KS)

9. 震盪混合器 (Vortex-genie 2, Scientific industries) 10. Pipetment (Tipor-V, Orange scientific)

11. 96槽ELISA微量盤 (Greiner bio-one) 12. Pipet tips (Extra gene)

三、抗氧化成分之研究

(一)抗氧化活性之研究：

1.Trolox 當量的總抗氧化能力測定 (Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC) ¹⁷⁷

ABTS 以 去 離 子 水 溶 解 使 成 濃 度 7mM ， 加 入 2.45mM 之 potassium peroxodisulfate。將此溶液於室溫下置於暗室反應 16 小時，

使其生成穩定之藍綠色 ABTS⁺‧自由基。然後再以乙醇稀釋使在分 光光度計 734 nm 下，其吸光值為 0.75 ± 0.05 的 ABTS⁺‧離子溶 液。加入不同濃度的標準品 (trolox) 2 μL 於 20 μL 乙醇溶液中，再 混合180 μL ABTS⁺‧離子溶液，在一分鐘內由分光光度計734 nm 下 測其吸光值，做成 trolox 之檢量線。樣品(取濃度 125 μg/mL)及對照 組(乙醇或二次水)檢測同上，測得後再由 trolox 的檢量線換算其相當 的濃度(mM)。TEAC 值表示 1000ppm 的樣品相當 trolox 標準溶液抗 氧化力之濃度值(mM)。

2.抗氧化能力的測定－Ferric reducing/antioxidant power (FRAP)¹⁷⁸

先配製下列3 種溶液：(A)醋酸緩衝液 (acetate buffer 300 mmol)：

醋 酸 鈉 ， pH 3.6 加 入 16 mL 醋 酸 ； (B)10 mmol/L TPTZ (2,4,6-tripyridyl-s-triazine) 加 入 40 mmol/L 鹽 酸 ； (C)20 mmol/L FeCl3‧6H2O。工作溶液為混合 25 mL A 溶液加入 2.5 mL B 溶液和 2.5 mL C 溶液。取新鮮配置的 FRAP 工作溶液 200 μL 在水浴 37 ℃ 下預熱，再以分光光度計在 593 nm 波長下做空白樣品(水)吸光度校 正。將不同濃度的FeSO4˙7H2O 5 μL 於 15 μL 乙醇溶液中，再混合 200 μL FRAP 工作溶液，在半分鐘內由分光光度計 593 nm 下測其吸 光值，做成 FeSO4˙7H2O 之檢量線。樣品檢測同上，測得後再由 FeSO4˙7H2O 的檢量線換算其相當的濃度。

3.DPPH 自由基清除染色法¹⁷⁹

將不同濃度的樣品及正對照組(GSH 和 BHT)依序以 3 μL 的量 負載在20 公分 × 20 公分的 TLC 板子(silica gel 60 F₂₅₄; Merck)上，

靜置使乾約 3 分鐘，待乾後，將 TLC 板子向上浸泡在盛有 0.4 mM DPPH 溶液的槽中約 10 秒，將 TLC 板子拿出陰乾，多餘的 DPPH 溶 液用薄紙輕輕擦拭，這時底色為紫色的 TLC 板子上若有呈現白點，

代表樣品有清除自由基的活性，出現白點的密度大小正比於DPPH 的 自由基清除能力。

4.DPPH 自由基清除效應¹⁸⁰

在96 槽的微量平盤中加入 30 μL 不同濃度的試驗樣品之溶液與 正對照組(GSH、BHT)，之後再加入 120 μL 的 100 mM Tris-HCl buffer ( pH 7.4)，隨即迅速加入 150 μL DPPH 乙醇溶液(500 μM )，使最後體 積成為 200 μL。均勻混合後於室溫下避光靜置 20 分鐘，之後以分光 光度計，波長 517 nm 下，測其吸光值。當 DPPH 自由基被清除越多 時，其吸光值會下降的愈多，利用相對於空白對照組的吸光值下降百 分比，可判斷各試驗樣品清除 DPPH 自由基能力之強弱，亦即表示 試驗樣品供氫能力之強弱。清除力計算公式如下：【1- (ABS _sample /ABS

control)】×100。

5.還原力測定^181,182

取200 μL 適當濃度的試驗品溶液(以不同濃度的 GSH 及 BHT 溶 液做正對照組)，加入 200 μL 200 mM 磷酸緩衝液 (pH 6.6) 與 1 mL 1% 赤血鹽 (potassium ferricyanide)。之後於 50℃水浴反應 20 分鐘，

急速冷卻後，加入1 mL 10% trichloroacetic acid 溶液 (以 95% 乙醇 製備)。於 6000 rpm 離心 10 分鐘。取上清液 100 μL 加入 100μL 蒸 餾水及20 μL 0.1% ferric chloride (FeCl3‧H2O)溶液混合均勻後，置放 10 分鐘，測定 700 nm 之吸光值。吸光值愈高，則表示樣品還原力愈

強。其計算公式如下：

ABS sample － ABS control (△700nm)

四、抗氧化成分之研究：

1.總多酚類(polyphenols)含量測定 ¹⁸²

以(+)-catechin 為標準品，做成檢量線。取 20 μL 樣品溶液，加 入 200 μL 之蒸餾水，混合均勻，再加入 40 μL 的 Folin-Ciocalteu 試 劑，靜置5 分鐘，再加入 40 μL 之 20％碳酸鈉(sodium carbonate)溶 液，再以 680 nm 測其吸光值並計算總多酚類含量。總多酚類含量以 mg (+)-catechin equivalent/g dry weight 表示。

2.總類黃酮(flavonoids)含量測定 ¹⁸³

以rutin 為標準品，做成檢量線。取 100 μL 樣品溶液，加入 100 μL 2%之 AlCl3˙6H2O 甲醇溶液，混合均勻，靜置 10 分鐘，再以 430 nm 測 其 吸 光 值 並 計 算 總 類 黃 酮 含 量 。 總 類 黃 酮 含 量 以 mg rutin equivalent/g dry weight 表示。

3.總黃酮醇(flavonols)含量測定¹⁸⁴

以(+)-catechin 為標準品，做成檢量線。取 40 μL 樣品溶液，加 入 200 μL 0.1%之 p-dimethylaminocinnamaldehyde (DMACA)溶液，混

合均勻，靜置 10 分鐘，再以 640 nm 測其吸光值並計算總黃酮醇含 量。總黃酮醇含量以mg (+)-catechin equivalent/g dry weight 表示。

五、抑制α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)之研究：

此部份實驗所用水萃取物樣品仍溶於二次水。實驗步驟依Tadera 等¹⁴⁸人的方法加以修飾，取20 μL 適當濃度的試驗品溶液(以不同濃 度的(+)-catechin 及 quercetin 溶液做正對照組)，加入 100 μL 3 mM 之 4-nitrophenyl α-D-glucopyranoside 溶液(溶於 pH 6.8 的磷酸緩衝液 中)，再加入 20 μL 的 α-glucosidase 溶液(0.5 U/mL)，置於 37℃下反 應30 分鐘，再以 400 nm 測其吸光值。吸光值愈低，表示抑制活性 愈強。抑制率計算公式

如下：【1- (ABS sample /ABS control)】×100％。

六、醛糖還原酶抑制之研究

(一)抽取醛糖還原酶 ¹⁸⁵

取大鼠眼球，剪開取出水晶體（lenses），加入冰冷 50 mM potassium phosphate buffer，冰浴均質，用冰冷磷酸緩衝液沖洗 ，離 心，4℃，3000 rpm，15 分鐘，取上清液加入濃縮管，離心，4℃，4000 rpm，15-30 分，取濃縮液分裝，測酵素活性，蛋白質濃度。

(二)實驗步驟

取200 mM sodium phosphate buffer pH 6.6,100 uL，加入 100 mM NADPH 2 μL，和 AR, Test compound, H2O 共 80 μL，在 25℃下混合 均勻反應後，在OD340nm 下測得吸光值，每孔加入 20 μL, 100 mM glyceraldehyde 啟動反應，避光反應 15 分，測 NADPH 消耗量(340 nm)

七、統計分析：

本研究實驗結果之數據，皆以mean ± S.D.表示，在以 SAS 軟體 進行 two-way 及three- wayANOVA 變異性分析，Fisher’s least significant difference test，進行組間比較。P＜0.05 時，表示具有統計 上差異。