原位雜合反應

2.3.1 解剖豌豆蚜蟲

從豌豆 Pisum sativum 上取 4 齡以上的豌豆蚜蟲 Acyrthosiphon pisum 移到培養 皿中。準備新鮮的 20% paraformaldehyde，以 1× phosphate-buffered saline (PBS) 稀釋成 4% paraformaldehyde / PBS。加 4% paraformaldehyde / PBS 到解剖盤上，

將蚜蟲放入 4% paraformaldehyde / PBS 中解剖，先去除胸節上的六足，接著用鑷 子固定腹部末端，用另一隻鑷子從腹部側面撕開蚜蟲，即可看到成串的微卵管，

接著去除粘附的體壁組織和消化道，收集 2~4 隻蚜蟲的微卵管後用微量吸管吸起，

移到含有少量 4% paraformaldehyde / PBS 的微量離心管中，整個過程微卵管都不 可以離開液面，以免造成互相纏繞而影響原位雜合的效果。加入同體積的 heptane 並用旋轉震盪混合器 (interlli mix RM-2, Elmi) 在室溫下持續旋轉 4 小時或在 4°C 放隔夜，去除下層 4% paraformaldehyde / PBS，加入同體積的 methanol 旋轉 5 分 鐘，去除大部分液體。加 700 µl methanol 旋轉 5 分鐘，去除 methanol，重覆此步 驟 2 次，加 700 µl methanol 後，保存於 -20°C 冰箱中。

2.3.2 原位雜合反應

先使存放 -20°C 已脫過水的微卵管再度水合，以 methanol 和 1× phosphate-buffered saline (PBS) 分別配製出 3：1、1：1 和 1：3 比例溶液，加入 500 µl 各比 例溶液並旋轉 5 分鐘，去除該溶液並重覆此步驟 (去除溶液時，仍須保留約 50~100 µl 溶液，避免微卵管離開液面)，以 700 µl 0.1% PTw （1× PBS，0.1%

Tween-20） 重覆清洗 4 次，每次旋轉 5 分鐘。加 500 µl hybridization buffer - (Hyb-) (50% formamide，5× sodium chloride / sodium citrate (SSC)，0.1% Tween-20)，並放入雜合烘箱中 (hybridization oven, YIH DER RH-800) 在 68°C 震盪 10 分

鐘，同時準備 hybridization buffer + (Hyb+) (50% formamide，5× sodium chloride / sodium citrate (SSC)，0.1% Tween-20，5 mg / ml yeast RNA，50 µg / ml heparin) 加 熱至 68°C，去除 Hyb- 並加入 500 µl Hyb+ 在 60~72°C (溫度需經多次調整至呈色

detection buffer (100 mM Tris-Cl，100 mM NaCl，500 mM MgCl2，0.1% Tween-20，

1 mM levamisole；pH 9.5) 在室溫下旋轉 5~10 分鐘，去除溶液，重覆加入 1×

detection buffer 此步驟 2 次。準備 AP substrates，加 20 µl NBT/BCIP stock solution

(Nitroblue tetrazolium (NBT) 18.75 mg / ml，5-bromo-4-choro-3-indolyl phosphate (BCIP) 9.4 mg / ml，Roche) 到 1 ml 1× detection buffer (含 1 mM levamisole)，將微 卵管以微量吸管移到玻璃解剖盤，加上 200 µl AP substrates (NBT/BCIP)，放在 4°C 冰箱呈色，每小時觀察一次。呈色完成後，紀錄呈色時間並加 0.1% PTw 來 中止呈色反應，並將微卵管移回原本的微量離心管，加 700 µl 0.1% PTw 在室溫 下旋轉 10 分鐘，去除溶液，重覆加入 0.1% PTw 此步驟 2 次。將 1000× 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI，2 ng / µl) (Sigma) 以 0.1% PTw 稀釋成 1× DAPI，

加 500 µl 1× DAPI 在室溫下旋轉 1 小時或 4°C 震盪至隔夜 (加入 1× DAPI 之後的 步驟都需要避光)，去除溶液，加 700 µl 0.1% PTw 在室溫下旋轉 10 分鐘，去除溶 液，重覆加入 0.1% PTw 此步驟 3 次。加入 500 µl 70% glycerol，以鋁箔紙或紙盒 保管避免光線，放入 4°C 冰箱震盪至隔夜，保存在 4°C 冰箱。

若要進行雙原位雜合反應 (double in situ hybridization)，在探針雜合時，就需 將兩種不同標誌的探針 (DIG / FL labeling probe) 放入同一管 Hyb+ 中，後續步驟 或 Fast blue (Sigma) 去呈色時，注意使用的 1× detection buffer 是不同的 ，Fast red 是用一顆 Fast red tablet (Roche) 溶在 2 ml 1× detection buffer (0.1 M Tris-HCl，

0.1% Tween-20 ， 1 mM levamisole ， pH 8.2) ； 取 20 µl 4-benzoylamino-2,5-diethoxybenzenediazonium chloride hemi[zinc chloride] (Fast Blue BB) salt (50 mg / ml) 和 10 µl naphtjol-AS-MX-phosphate (NAMP) (50 mg / ml) (Sigma) 到 1 ml 1×

detection buffer (0.1 M Tris-HCl，0.1% Tween-20，1 mM levamisole，pH 8.2)。

呈色完成的微卵管在 70% glycerol 中，以微針來分離各個不同時期的胚胎，

將單獨的胚胎放置於載玻片上，並蓋上蓋玻片，當胚胎時期大於 stage 11 時，需 要先放置一塊蓋玻片當作架橋的支點，避免胚胎被蓋玻片壓碎，在蓋玻片四周塗 上指甲油封片，用 Leica DMR (Leica) 和 Fuji FinePix S2 Pro digital camera (Fujifilm) 來拍照，細胞核染色 (DAPI staining) 是用 Leica TCS SP5 Confocal Spectral Microscope Imaging System 來拍照。