蛋白質表現

2.4.1 設計引子與接合反應

除了目標基因 Appar-1 本身的專一性引子序列外，必須在前後引子各加上 6 nt 序列為特定限制酶 (前後引子需用不同限制酶) 辨識位置，並在 reverse primer 3' 設計額外的終止密碼子 (stop codon)，以生物資訊軟體 MacVector 去計算從載體 pET-32a (+) (Novagen) 的起始密碼子 (start codon) 到目標基因終止密碼子的 inframe 是否正確可以轉譯出蛋白質，最後設計出 forward primer

Ap_par-1_F1858_NcoI：

5'- CATGCCATGGCTCAAGATTTCAAAGAACCAAAACG -3'，

Ap_par-1_F2356_NcoI:

5'- TATACCATGGCTAGTACTAATTTCAAGCGTCAA -3'；

reverse primer Ap_par-1_R2355_HindIII:

5'- AGCTAAGCTTCTATGGAATGGCCACATTATG -3'，

Ap_par-1_R2877_HindIII:

5'- AGCTAAGCTTCTAAAACTTGGATGATATTTTTGA -3'

由已定序的 Appar-1_T&A 質體配合上述的引子做 PCR 並回收產物 (步驟參 照 2.2.3)，將產物和載體 pET-32a (+) 分別用限制酶 NcoI 和 HindIII 處理 (步驟參 照 2.2.6，但兩個限制酶同時使用並需要加入 BSA)，處理 1 小時後以 1% DNA gel 進行電泳來檢查產物和載體的情況，確認有限至酶處理後進行 DNA 沈澱 (參照 2.2.7) 並以光度計 (eppendorf biophotometer) 測液體中 DNA 濃度。取 1 µl pET-32a (+)、1-3 µl PCR 產物 (載體和 DNA 片段的 molecular ration為 1：1~1：2)、5 µl 2×

Rapid ligation buffer (Promega)、1 µl T4 ligase (Promega) 到微量離心管中，充分均 勻混合後，放置於 4°C 冰箱過夜，經轉型步驟(參照2.4.2) 後剩餘的溶液可存放至 -20°C 冰箱。

2.4.2 C41 勝任細胞處理和轉型

取出存放在 -80°C 冰箱中的 E. coli mutant strain C41(DE3) 移到液態氮中，以 微量吸管尖黏附些許 C41 菌液，塗劃在不含有 ampicillin 的 LB agar 培養皿上，

在 37°C 培養箱中培養約 14~16 小時，以微量吸管尖挑選單一菌落，放入 3 ml LB medium 在 37°C 培養箱中以 250 rpm 培養 14~16 小時，取 100 µl 培養過的 LB medium 加到 20 ml LB medium 中並在 37°C 培養箱中以 250 rpm 培養 2.5 小時，

LB medium 移到 50 ml 離心管中，在 4°C 下以 800 x g 離心 10 分鐘，去除上清液 並加入5ml 100 mM CaCl2 (0~4°C)，劇烈搖晃，放在冰上靜置 2 小時，在 4°C 下 以 800 x g 離心 10 分鐘，加入 1 ml 100 mM CaCl2 (0~4°C)，在冰上以 64 µl C41 勝 任細胞混合液加上 36 µl 60% glycerol 分裝到微量離心管中 (總體積 100 µl)，放入 液態氮中急速冷凍，保存至 -80°C 冰箱中。

將 Appar-1_pET-32a (+) 轉型進入 C41 勝任細胞前，應先轉入 JM109 中，萃

取質體定序並確認序列完全正確，轉型進入 JM109 和萃取質體步驟同 2.2.4 和 2.2.5，以生物資訊軟體 MacVector 確定序列絲毫沒有誤差。從 -80°C 冰箱中取出 C41 勝任細胞並放在冰上解凍，取 2 µl 序列無誤的質體到 100 µl C41 勝任細胞中 並混合均勻，在冰上靜置 30 分鐘，移到 42°C 水浴槽加熱 2 分鐘，馬上移到冰上 2 分鐘，加入 400 µl 2× YT buffer (1.6% tryptone，1% yeast extract 和 0.5% NaCl)，

在37°C 水浴槽中 1 小時，取 100 µl 處理過的 C41 勝任細胞和 20 µl 20% IPTG 均

4% SDS，0.2% bromophenol blue，20% glycerol) (用前加入適當 β-mercaptoethanol，

最終濃度為 200 mM) 並震盪混合均勻，90°C 乾浴槽加熱 10 分鐘，移到冰上靜置 2 分鐘，在 4°C 冰箱以 14000 x g 離心 10 分鐘，收集上清液到另一管微量離心管 中，加 10 µl 上清液到 SDS-PAGE gel (做法參照 2.5.3) 的孔洞中，加 5 µl

prestained protein ladder (green 10 kDa band，Bioman) 到SDS-PAGE gel的孔洞中，

第一階段以 80 Voltage (V) 跑電泳 30 分鐘，第二階段以 120 V 跑電泳 120 分鐘，

將下層膠體取出，浸泡在 Coomassie staining solution (0.1% Coomassie Brilliant Blue R-250，50% methanol，10% glacial acetic acid) 30 分鐘以上，置換至 destain buffer (10% methanol，5% glacial acetic acid) 搖晃清洗至看得清楚各個蛋白質條帶 (band)，置換至清水清洗至隔夜，最後以透明玻璃紙將膠體密封保存。 protein ladder (green 10 kDa band，Bioman) 到SDS-PAGE gel的孔洞中，第一階段 以 80 Voltage (V) 跑電泳 30 分鐘，第二階段以 120 V 跑電泳 120 分鐘，將下層膠 體取出，浸泡在 Coomassie staining solution (0.1% Coomassie Brilliant Blue R-250，

50% methanol，10% glacial acetic acid) 30 分鐘以上，置換至 destain buffer (10%

methanol，5% glacial acetic acid) 搖晃清洗至看得清楚各個蛋白質條帶 (band)，置

換至清水清洗至隔夜，最後以透明玻璃紙將膠體密封保存。