合成探針

2.2.1 萃取 total RNA 和反轉錄

從培養植物上取三齡以上的豌豆蚜蟲約 10~25 mg (20~50 隻左右)，放入微量 離心管內並以液態氮急速冷凍。取 400 µl RB Buffer (Geneaid) 與 4 µl β -mercaptoethanol 混合，分兩次注入含蚜蟲的離心管內，第一次加入混合液 (202 µl) 後，以滅過菌的 micropestle 裝在 pellet pestle (Sigma-Aldrich) 上並加以攪拌數次，

取出 micropestle 並加入剩餘的混合液，放置室溫 5 分鐘。將 Filter Column (Geneaid) 裝在 2 ml Collection Tube (Geneaid) 並加混合液到 Filter Column 中，以 1000 x g 離心 1 分鐘，去除 Filter Column，加 400 µl 70% ethanol 到濾液中並搖晃 混合均勻。將RB Column (Geneaid) 裝在 2 ml Collection Tube 並加混合液到 RB Column 中，以 16000 x g 離心 2 分鐘，去除濾液。加 400 µl W1 Buffer (Geneaid)

到 RB Column 中，以 16000 x g 離心 1 分鐘，去除濾液。加 600 µl Wash Buffer (Geneaid) 到 RB Column 中，以 16000 x g 離心 1 分鐘，去除濾液，重複加入 Wash Buffer 並離心去除濾液，以 16000 x g 離心 3 分鐘來脫乾。將 RB Column 裝 在微量離心管上，加入 50 µl RNase-free water (Geneaid) 到 RB Column 膜中心，室 溫下靜置 3 分鐘，以 16000 x g 離心 1 分鐘。以光度計 (eppendorf biophotometer) 0.1 M DTT (Bionovas)、1 µl RNase inhibitor (40 U / µl, Invitrogen) 和 1 µl HiScript I Reverse Transcriptase (Bionovas)，混合均勻後，加熱到 42°C 60 分鐘，加熱到 70°C 15分鐘，放在 -20°C 冰箱保存。

2.2.2 設計專一性引子

由於豌豆蚜蟲 Acyrthosiphon pisum 的基因體在 2010 年時被解序了 (the international aphid genomics consortium, 2010)，其資料庫 aphidbase 也被釋出供人 查詢 (http://www.aphidbase.com/aphidbase/)，此研究計畫中所研究的基因，是先由 其他模式昆蟲如 Drosophila melanogaster、Tribolium castaneum、Apis mellifera 和 Nasonia vitripennis 的已知相關基因序列，在 aphidbase 上進行 Blastp 並拿積分最 高的前 20 項序列，至 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 以 reciprocal Blastp 的 方式，看能否對應到各物種的目標基因，同時也參照其他豌豆蚜蟲發育基因相關 文獻 (Shigenobu et al., 2010) 來確認基因是否正確，取得蚜蟲的目標基因後，以生 物資訊軟體 MacVector 中的 primer design 功能來設計各個基因的專一性引子，引 子的選擇盡量以包含保守和非保守區段為主。下為本研究所用到的各基因的專一 性引子 (F 為 forward; R 為 reverse)：

Aptoy_F138：5'- CGAACCATTTTGGAAGATGCCTC -3' Aptoy_R589：5'- TGTTGTCGTTGCTACACACCCC -3' Apeya_F2295：5'- CGAAACCATCATCGTGTTCAACTC -3' Apeya_R2614：5'- ACGCCAACTTCCTCATCCAGTC -3' Apeyg_F73：5'- CTGATTGGTGGAAGCAAACCC -3' Apeyg_R753：5'- TTCGGACAAACTGGTCTTGGC -3' ApEGFR_F2540：5'- TGATTCTTGTATGGCACTGGCG -3' ApEGFR_R3212：5'- CATTTCACAGGCATCTTTCCACC -3' Aptgfα_F1：5'- ATGTCGAAAAGGACGCTGAGAAACC -3' Aptgfα_R863：5'- ACGATCAAAGGTTCTTGTCGCGAA -3'

Appar-1_F1858：5’- CAAGATTTCAAAGAACCAAAACG -3’

Appar-1_R2877：5’- AAACTTGGATGATATTTTTGAAAAG -3’

2.2.3 PCR 操作和產物回收

準備數管 PCR tube，除了所需的管數外，還需要包含 positive control 和 negative control，各個PCR tube 內需有 6.1 µl ddH2O、1 µl 10× PCR buffer (Bioman)、1 µl 2.5 mM dNTPs (Bioman)、0.1 µl BioTaq DNA polymerase (Bioman)、

0.4 µl 25 µM gene specific forward primer、0.4 µl 25 µM gene specific reverse primer 和 1 µl cDNA (0.1 µg) ； positive control 使 用 的 primer 為 actin_F84 (5'- AATCCTgTTgACCgAAgCCC -3') 和 actin_R532 (5'- TTCCgATggTgATgACCTgTCC -3') ；negative control 則是不加入 cDNA。放入 PCR machine (Applied Biosystems) 中執行下列的工作：(1) 94°C 處理 5 分鐘，(2) 94°C 處理 30 秒，(3) 45-60°C 處理 30秒，(4) 70°C 處理 0.5~1.5 分鐘，(5) 重複步 驟 (2)~(4) 39 次，(6) 70°C 處理 10 分鐘，(7) 10°C 保存。若為第一次使用的 primer，則需在步驟 (3) 中測試適合的 annealing temperature (45~60°C)，步驟 (4) 中的時間是以目標片端的大小而定：0.5 kb 則用 30 秒，1 kb 用 1 分鐘，1.5 kb 用 1.5 分鐘。以 DNA agarose gel (2%) 進行 DNA 電泳，每個樣品取 3 µl 並加上 1 µl 6× sample dye (Bioman)，以 80 V 執行 35 分鐘，用電泳照膠系統 (Major science DI-01) 拍照。

製作 1片 DNA gel (2%) 是取 15 ml 1× TAE buffer (Bioman) 和 0.3 g agarose (Bioman) 並在血清瓶內混合，以微波爐小心地微波加熱，注意瓶蓋鬆緊以避免瓶 內外壓力差使得瓶身破裂，待其溶液呈現透明澄清時，稍微靜置冷卻，加入 0.75 µl EtBr (0.625 mg / ml，aMRESCO) 並混合均勻，倒入鑄膠器中，去除液體中的氣

泡並差上齒梳，在通風的環境下靜置約 1 小時，即可使用。先在 DNA 電泳槽中 倒入 1× TAE buffer 並放好 DNA gel，將 DNA 樣品 (需加上適量的 6× sample dye) 加到 DNA gel 的孔洞中，並以 80 Voltage 進行 40 分鐘，用電泳照膠系統 (Major science DI-01) 拍照。

確定好適合的條件後，再做一次大量的 PCR 操作，並且做完 DNA 電泳後，

將含有 PCR 產物的膠體放在 UV 箱上，做好防護措施後打開 UV 光，先確認片段 大小是否正確，然後用刀片將該區塊切下來並放到微量離心管內，加 500 µl PG Buffer (Bioman) 後混合均勻，加熱到 55°C 15分鐘，過程中每 3 分鐘就混勻一次，

將 Spin Column (Bioman)裝在 Collection Tube (Bioman) 上，將膠體溶液移至 Spin Column 中並以 6000 x g 離心 30 秒，去除濾液。加 500 µl Wash Buffer (Bioman) 並以 6000 x g 離心 30 秒，去除濾液，以 16000 x g 離心 2 分鐘，將 Spin Column 裝在微量離心管上，加 15 µl Elution Buffer (Bioman) 到 Spin Column 膜中央，靜 置 2 分鐘，以 16000 x g 離心 2 分鐘，放在 -20°C 冰箱保存。

2.2.4 接合反應和轉型

接合反應中載體和 DNA 片段的 molecular ration 固定為 1：3。取 1 µl 10×

Rapid ligation buffer (New England BioLabs)、6 µl PCR product (由 2.2.3 方法回收 的產物)、2 µl T&A vector (25 ng / µl, RBC Bioscience)、1 µl T4 ligase (New England BioLabs) 到微量離心管中，充分均勻混合後，放置於 4°C 冰箱過夜。

加 2 µl 接合反應的產物到 50 µl HIT E. coli competent cells (JM109, RBC Bioscience)，以輕微震盪 1 秒鐘來混合，放置於冰上 10 分鐘，另混合 14 µl 20%

IPTG 和 80 µl X-gal 來準備進行藍白篩選。取兩盤 LB agar 培養皿 (含 ampicillin) 並放在室溫回溫後，先在其中一盤上加上 47 µl IPTG 和 X-gal 混合液，然後加上

35 µl 轉型 JM109 cells，用玻璃棒使菌液塗勻；另一盤同樣加上47 µl IPTG 和 control)，放入 PCR machine (Applied Biosystems) 中執行下列的工作：(1) 94°C 處 理 5 分鐘，(2) 94°C 處理 30 秒，(3) 55°C 處理 30秒，(4) 70°C 處理 1~1.5 分鐘， ligation buffer (Promega)、3 µl PCR product、1 µl pGEM-T easy vector (50 ng / µl, Promega)、1 µl T4 ligase (Promega) 到微量離心管中，充分均勻混合後，放置於 4°C 冰箱過夜。後續步驟同第二段，惟藍白篩選所用的 PCR primer 不同，改用 0.4 µl 25 µM T7 primer (5'- TAATACGACTCACTATAGGG -3') 和 0.4 µl 25 µM Sp6 primer (5'- AGCTATTTAGGTGACACTATAG -3')，最後同樣挑選符合預計大小片

段 DNA 的菌落，送至生技公司加以定序，進行第二次檢查。

2.2.5 養菌和質體萃取

準備含有 3~10 ml LB medium (Luria-Bertani medium) 的離心管 (LB medium 體積不超過離心管體積的 30%，以免影響氧氣的含量)，加入適量的 ampicillin (50 mg / µl) 使最終濃度為 100 mg / µl ampicillin，以微量吸管尖挑選出單一菌落並置 入於 LB medium 中，同時將新的微量吸管尖放入另一 LB medium 當做 negative control。以膠帶固定蓋子，使之不脫落並能讓氣體流通，將各個離心管放入迴轉 式震盪培養箱 (TKS OSI500R) 中，以 240 rpm 在 37°C 培養 12~14 小時。培養完 後，取 500 µl 菌液加到含有 500 µl 60% glycerol 微量離心管中，以震盪來混合均 勻後，放入液態氮中急速冷凍，保存至 -80°C 冰箱。

取 1~3 ml 菌液，加到微量離心管中，並以 13000 x g 離心 1 分鐘，去除上清 液，在含有菌體沈澱物的離心管中加入 200 µl P1 Buffer (Genomics) 並充分混合，

加入 200 µl P2 Buffer (Genomics)，溫和地翻轉 10~20 次，加入 300 µl P3 Buffer (Genomics) 並馬上溫和地翻轉 10~20 次，以 13000 x g 離心 10 分鐘，取上清液移 到另一管微量離心管中，再以 13000 x g 離心 10 分鐘，確保沒有白色沈澱物漂浮。

將上清液移到 GP3 column (Genomics)，以 13000 x g 離心 1 分鐘，去除濾液。在 GP3 column 中加入 500 µl PD Buffer (Genomics)，以 13000 x g 離心 1 分鐘，去除 濾液。在 GP3 column 中加入 500 µl PW Buffer (Genomics)，以 13000 x g 離心 1 分鐘，去除濾液。以13000 x g 空管離心 2 分鐘，開蓋並放置室溫下 15 分鐘以上，

將 GP3 column 移至新的微量離心管上，加 100 µl EB Buffer (Genomics) 並放置室 溫 2 分鐘，以13000 x g 離心 1 分鐘，去除 GP3 column，以光度計 (eppendorf biophotometer) 測濾液中質體濃度，並以 1% DNA gel電泳確認質體情況後，將微

量離心管放到 -20°C 冰箱保存。

2.2.6 限制酶處理

將含有目標基因序列的載體 pGEM-T easy 送至生技公司加以定序，並以生物 資訊軟體 MacVector確定目標基因的序列和方向以及限制酶切位是否正確，若需 轉錄的序列與 T7 promoter 同向，則以 SpeI 限制酶去處理質體，以作為之後反義 股探針 (antisense probe) 的模板，另以 NcoI 限制酶去處理質體，以作為之後義股 探針 (sense probe) 的模板；若需轉錄的序列與 SP6 promoter 同向，則使用的限制 酶正好相反。

確認質體濃度後，取 2 µg 質體至微量離心管中，並加入 8 µl NEBuffer 4 (New England BioLabs)，加入 1 µl NcoI or SpeI (10000 U / ml, New England BioLabs) (若使用 SpeI 則需另加入 0.8 µl 100 µg / ml BSA)，剩下以二次水加至總體積為 80 µl 並且混合均勻，放入 37°C 培養箱中反應 4~4.5 小時，取 3 µl 混合液去做 DNA 電泳 (1% DNA agarose gel)，同時用1 µl 質體當positive control，確認質體已被限 制酶處理成 linear form，即可接續 DNA 沈澱的步驟。

2.2.7 DNA 沈澱

估算要進行 DNA 沈澱的液體體積，加入 1/10 倍體積的 3 M sodium acetate (pH 5.2)，加入 2 倍體積的 99% (v/v) ethanol (-15~-25°C) 並混合均勻，放入 -80°C 冰箱 30 分鐘以上，在 4°C 以 13000 x g 離心 10 分鐘，去除上清液，加 50 µl 70%

(v/v) ethanol (4°C) 並混合均勻，在 4°C 以 13000 x g 離心 5 分鐘，去除上清液，

加 50 µl 70% ethanol (4°C) 並混合均勻，在 4°C 以 13000 x g 離心 5 分鐘，去除上 清液，開蓋子放室溫下數分鐘以移除 ethanol，加 25 µl 二次水回溶，保存至 -20°C 冰箱。

2.2.8 胞外轉錄 (in vitro transcription)

取 6.75 µl 限制酶處理過的質體 (NcoI / SpeI cut plasmid, 100~400 ng) 到微量離 心管中，加 1 µl 10× RNA polymerase buffer (New England BioLabs)、0.25 µl RNase inhibitor (40 U / µl, Invitrogen)、1 µl 10× DIG/Fluorescein RNA labeling mix (Roche) 和 1 µl T7 polymerase (50000 U / ml, New England BioLabs) / SP6 polymerase (20000 U / ml, New England BioLabs)，總體積為 10 µl 並混合均勻，放入 37°C 培養箱中 反應 4 小時，加入 1 µl 0.2 M EDTA (pH 8.0) 來中止反應，接著緊接著 RNA 沈澱 的步驟。

2.2.9 RNA 沈澱

估算要進行 RNA 沈澱的液體體積，加入 1/10 倍體積的 3 M sodium acetate (pH 5.2)，加入 2.5 倍體積的 99% (v/v) ethanol (15~25°C) 並混合均勻，放入 -80°C 冰箱 30 分鐘以上，在 4°C 以 13000 x g 離心 20 分鐘，去除上清液，加 50 µl 70% (v/v) ethanol (4°C) 並混合均勻，在 4°C 以 13000 x g 離心 3 分鐘，去除上清 液，加 50 µl 70% ethanol (4°C) 並混合均勻，在 4°C 以 13000 x g 離心 3 分鐘，去 除 上 清 液 ， 開 蓋 子 放 室 溫 下 數 分 鐘 以 移 除 ethanol ， 同 時 加 熱 含 diethyl pyrocarbonate (DEPC) 二次水到 37°C，加 50 µl DEPC 二次水到含 RNA 沈澱的微 量離心管中，加熱到 37°C 15 分鐘，然後以光度計 (eppendorf biophotometer) 測其 中 riboprobe 濃度，並以 RNA gel 電泳確認 riboprobe 情況，將液體保存在 -80°C 冰箱中，若需長期保存，則可以加入同體積的 hybridization buffer (50% formamide, 5× sodium chloride / sodium citrate, 0.1% Tween-20) 後放入 -80°C 冰箱中保存。