體軸決定基因和眼部發育基因在孤雌胎生豌豆蚜之表現分析

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國立臺灣大學生物資源暨農學院昆蟲學系暨研究所碩士論文

Department and Graduate Institute of Entomology College of Bioresources and Agriculture

National Taiwan University Master Thesis

體軸決定基因和眼部發育基因在孤雌胎生豌豆蚜之表現分析

Developmental Analysis of Genes Involved in Axis Determination and Eye Development in the

Parthenogenetic and Viviparous Pea Aphid Acyrthosiphon pisum

姜乃瑋 Nai-Wei Chiang

指導教授：張俊哲博士 Advisor: Chun-Che Chang, Ph.D.

中華民國 102 年 7 月

July 2013

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口試委員會審定書

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致謝

從我進入張俊哲教授的實驗室至今已過了三個寒暑，這過程中面臨了許多的困難和挑戰，種種的難關並非單靠一己之力便能解決，我要感謝這當中許多幫助我的人。首先要感謝張俊哲教授，願意接受一個沒有實驗經驗以及任何科學計畫的大學生，也願意騰出時間和提供寶貴的意見 (不論科學或是人生方面) 給涉世未深的我，令我能夠窺透科學活動的奧祕以及指導我如何培養專業的素養；感謝我的口試委員們：孫以瀚教授、蔡玉真教授以及林明德教授 (雖因天候因素不克前來)，能夠在百忙之際抽空來幫忙口試，且是在颱風襲捲臺灣的晚上，在口試過程中給予許多過去我尚未想到問題，以及各個領域的專業建議，使得論文和研究主題能夠邁向完善。感謝逸旻學長在我剛進實驗室時指導我如何作實驗，並且時時刻刻和我討論研究進度和意義，實在獲益良多；感謝曉鈴學姊對我蛋白質實驗的細心指導，以及願意聽我在實驗之外的不滿和不解，甚至人在國外之際還祝福我能口試順利；感謝成侑學長在實驗室開會時，不時給我新的思考方向以及敘述實驗結果該注意的部份，以及在作實驗時，會提醒我該注意的安全事項；感謝季瑋學姊指導我有關蛋白質實驗和抗體製作的相關知識，甚至在深夜作實驗時，能夠陪我聊天解悶，以及在每次專題討論時聽我預講以及提供大量的意見，並且也在論文格式和書寫內容上有許多有益的建議；感謝新進的實驗室成員羿岑、庭萱、

躍中和子霽，以及過去的成員小白學長、芷辰等對於我實驗上和事務的幫助。最後要感謝的是我的家人們，雖然平時家裡很難聽到感謝彼此的話，但我知道彼此互相的關心，已經能夠流露出感激之情，謝謝你們能在我困惑和迷惘之時，支持以及體諒我。

在我從大學生涯一直到研究所畢業這段時間，藉由經歷許多大大小小的事情以及不斷檢視自己對這些事情的反應，多多少少能夠注意到自己在心態上的改變，

這心態的改變正如同德國哲學家尼采所說的精神三變，大學時代的我正如同駱駝一般，盡自己該做的本分，以及做別人建議的事；到研究所時，就便成獅子，將被動轉換為主動，在沒有人逼迫的情況下，找尋實驗的方向並且為其負責，甚至是知道自己需要的是什麼；希望我在離開臺灣大學這搖籃時，我已蛻變成嬰兒，

能夠專注活在每個當下，並且踏實地過著自己期許的生活。

民國一百零二年八月十五日

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圖目錄

圖一 TGFα 蛋白序列在各物種之間的比較... 89

圖二 EGFR 蛋白序列在各物種之間的比較... 90

圖三 Par-1 蛋白序列在各物種之間的比較... 92

圖四 Twin of eyeless 蛋白序列在各物種之間的比較... 93

圖五 Eyes absent 蛋白序列在各物種之間的比較 ... 94

圖六 Eyegone 蛋白序列在各物種之間的比較... 95

圖七 Aptgfα 載體和其探針合成意示圖... 96

圖八 ApEGFR 載體和其探針合成意示圖... 97

圖九 Appar-1 載體和其探針合成意示圖... 98

圖十 Aptoy 載體和其探針合成意示圖... 99

圖十一 Apeya 載體和其探針合成意示圖...100

圖十二 Apeyg 載體和其探針合成意示圖...101

圖十三 偵測 Aptgfα mRNA 在豌豆蚜蟲卵細胞和胚胎發育的表現...102

圖十四 偵測 ApEGFR mRNA 在豌豆蚜蟲卵細胞和胚胎發育的表現...103

圖十五 偵測 Appar-1 mRNA 在豌豆蚜蟲卵細胞和胚胎發育的表現...104

圖十六 偵測 Aptoy mRNA 在豌豆蚜蟲卵細胞和胚胎發育的表現...105

圖十七 偵測 Apeya mRNA 在豌豆蚜蟲卵細胞和胚胎發育的表現...107

圖十八 偵測 Apeyg mRNA 在豌豆蚜蟲卵細胞和胚胎發育的表現...109

圖十九 ApPar-1 fusion protein 表現與純化...110

圖二十 ApPar-1 西方墨點法...111

圖二十一 ApPar-1 抗體染色在豌豆蚜蟲卵細胞和胚胎發育的訊號...112

圖二十二 dpERK 抗體染色在豌豆蚜蟲卵細胞的訊號...113

圖二十三 眼部特化基因在豌豆蚜蟲胚胎發育時期的表現...114

附錄一 豌豆蚜蟲之生活史 (Miura et al., 2003)...115

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中文摘要

黑腹果蠅 (Drosophila melanogaster) 的體軸取決於卵的不對稱性，而卵的不對稱性又源於表皮生長因子訊號 (EGF signaling) 的影響。目前已知在赤擬穀盜 (Tribolium castaneum) 、寄生蜂 (Nasonia vitripennis) 和黃斑黑蟋蟀 (Gryllus bimaculatus) 的卵發育過程中發現 EGF 訊號的表現，但卵的極性究竟是如何影響 體軸決定的仍是未知。在行無性生殖胎生豌豆蚜蟲 (Acyrthosiphon pisum) 的微卵管 (ovariole) 中，卵發育後緊接著是胚胎發育 (embryogenesis)，這提供絕佳的機會來觀察 EGF 訊號在卵和胚胎發育中的表現。藉由分析 EGF 訊號的相關基因和 par-1 基因的表現，期望能找出這些基因是否會在卵或胚胎發育過程中有不對稱的分布情形。另一方面，因為不完全變態昆蟲的眼部發育所知甚少，用無性生殖豌豆蚜蟲來作研究，希望能了解不完全變態昆蟲眼部是如何在胚胎發育中特化的，故選殖了在其他昆蟲中數個已知調控眼部發育的工具基因 (toolkit genes) 如 twin of eyeless (toy)、eyes absent (eya) 和 eyegone (eyg)，藉由原位雜合實驗去分析基因的表現，能初步了解蚜蟲在胚胎發育中 的眼部特化以及體軸決定機制是否類似於其他昆蟲。研究結果顯示 EGF 訊號可能與卵母細胞分化有關，但卻無法觀察決定背腹極性的現象，而 Par-1 蛋白質在卵母細胞中的分佈，可能與微管極性有關，進一步決定前後體軸。眼部發育基因的表現位置和比較，顯示不完全變態昆蟲眼部發育的過程，與已知完全變態昆蟲眼部發育上許多共同之處。

關鍵字：體軸決定、EGF 訊號、par-1 基因、昆蟲眼部發育、眼部特化基因

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ABSTRACT

Body axis determination in the fruit fly Drosophila melanogaster depends on the establishment of egg asymmetry through EGF (epidermal growth factor receptor) signaling between germline and somatic cells. EGF signaling has been identified in the oocytes of beetle Tribolium castaneum, wasp Nasonia vitripennis, and cricket Gryllus bimaculatus. However, whether the formation of egg polarity can drive the determination of body axes remains unclear.

Because in the asexual and viviparous pea aphid Acyrthosiphon pisum oogenesis and embryogenesis occur within the ovariole, this provides an excellent opportunity to observe how EGF signaling is patterned from oogenesis to embryogenesis consecutively. In order to understand how body axes are determined in the asexual pea aphid, we analyzed the developmental expression of genes involving EGF signaling and par-1 gene, aiming to find whether these genes are asymmetrically localized in oocytes and early embryos.

In order to understand how eyes are specified in hemimetabolous insects, we selected to study twin of eyeless (toy), eyes absent (eya), and eyegone (eyg), all of which are eye toolkit genes in insects. Through the analysis of in situ hybridization results, a preliminary scheme about how eyes are specified in the asexual pea aphid has been established and whether body axis determination in other model insect is different. EGF signaling may play a role in oocyte differentitaion but not in determination of body axes in asexual pea aphid.

Distribution of Par-1 protein indicates the polarity of microtubules, which determine localization of anterior-posterior determinant genes. The expression

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patterns and comparisons of eye specific genes in hemimetabolous insect indicate the conserved patterns of eye development with holometabolous insect.

Keywords: Body axes determination; EGF signaling; par-1 gene; Insect eye development; Eye specific genes.

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第一章前言

1.1 體軸決定

1.1.1 模式生物的體軸決定機制

觀察昆蟲卵的外觀便可知道，昆蟲在卵的時期便有前後和背腹體軸 (Gutzeit and Sander, 1985)，這說明體軸決定必然早在胚胎發育 (embryogenesis) 前便發生了，模式生物 Drosophila melanogaster (黑腹果蠅) 的體軸研究中，發現體軸決定發生在卵細胞發育 (oogenesis) 並藉由兩種方式決定 (1) 卵細胞內體軸決定物質的聚集 (2) 細胞外間質或體細胞的訊號誘發 (St Johnston and Nüsslein-Volhard, 1992;

Roth, 2003)。D. melanogaster 的微卵管 (ovariole) 中可分出各個不同時期的蛋腔 (egg chamber)，每個蛋腔都是由外層濾泡細胞 (follicle cell) 包覆 15 個營養細胞，

其營養細胞又以細胞質橋 (cytoplasmic bridges 又稱 ring canal) 連結 1 個卵細胞 (oocyte) 以及營養細胞彼此連結 (de Cuevas et al., 1997; Roth, 2003)，體軸決定機制 是發生在卵細胞發育中期 (Roth, 2003)，其主要藉助三種不同基因的 mRNA 在卵細胞內的聚集，而決定未來胚胎的前後和背腹軸 (Roth and Lynch, 2009)：卵細胞發育早期時 (stage 5~6)，卵細胞核藉由微管 (microtubule) 移動至後端，接著卵細胞核周圍的 gurken mRNA 轉譯成 Gurken 蛋白質 (EGF-like protein)，其 Gurken ㄉ蛋白質將與後端濾泡細胞上的表皮生長因子受體 EGFR (Epidermal growth factor receptor) 結合，傳遞 EGF 訊號進入濾泡細胞，接著由濾泡細胞傳送訊號回卵細胞，

使卵細胞內的微管組織中心 (microtubule organizing center, MTOC) 重新排列而改變卵細胞內微管極性的分佈 (González-Reyes et al., 1995; Neuman-Silberberg and Schüpbach, 1993)，在卵細胞發育中期 (stage 8~9)，bicoid mRNA 藉由重新排列過 的微管送至卵細胞前端，oskar mRNA 則由微管送至卵細胞後端 (Pokrywka and

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Stephenson, 1991, 1995)，bicoid 和 oskar mRNA 的前後聚集建立前後體軸，其聚 集會持續到胚胎發育的早期，而轉譯成蛋白質並且影響前後體軸上各個體節的發育 (St Johnston and Nüsslein-Volhard, 1992)。同樣在卵細胞發育中期 (stage 7~8)，

因 Gurken 蛋白質與 EGFR 結合促使微管極性改變，使得位於最末端的中心粒活化，並且以微管接觸卵細胞核的方式使細胞核移動至前端背側 (Zhao et al., 2012)，

當卵細胞核移至前端背側時，環繞在核周圍的 gurken mRNA 轉譯成 Gurken 蛋白質，與背側濾泡細胞上的 EGFR 結合並傳遞 EGF 訊號進入濾泡細胞，決定背側濾泡細胞的命運，促使 pipe mRNA 只表現在腹側濾泡細胞，建立卵細胞的背腹軸 (Sen et al., 1998)。

卵細胞體軸決定中，細胞骨架 (如：微管和肌動蛋白等) 扮演著相當重要的關鍵，在 D. melanogaster 中發現，調整微管動態平衡和極性的 par (partition- defective) 基因 (par-1, par-3, par-4, par-5 和 par-6) 有能力影響 oskar mRNA 的分布，

進而影響後端體節發育 (Shulman et al., 2000; Tomancak et al., 2000; Cox et al., 2001;

Suzuki and Ohno, 2006)。par 基因研究起源於 Canorhabditis elegans (秀麗隱桿線 蟲)，目前已知在線蟲胚胎發育中，aPKC (atypical protein kinase C)、Par-3 和 Par- 6 會在卵受精後聚集在細胞的前端，而 Par-1 和 Par-2 則聚集在細胞後端，使得線蟲胚胎的前後體軸被決定 (Etemad-Moghadam et al., 1995; Guo and Kemphues, 1995;

Boyd et al., 1996; Tabuse et al., 1998; Hung and Kemphues, 1999) ，類似的 aPKC/Par-3/Par-6 聚集的現象也發生在 Xenopus laevis (非洲爪蟾) 的卵細胞 (Nakaya et al., 2000) 以及 Phallus mamillata (海鞘) 的胚胎中 (Patalano et al., 2006)，

在脊椎動物和節肢動物中發現 par 基因可以決定細胞的極性，進一步影響個體的前後體軸 (Suzuki and Ohno, 2006; Goldstein and Macara, 2007)。

目前已知的昆蟲模式生物 D. melanogaster 是在昆蟲綱中較晚出現的雙翅目

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(Diptera) (Grimaldi and Engel, 2005)，且屬於完全變態昆蟲 (holometabolous insect，

生活史為：卵→幼蟲→蛹→成蟲)，胚胎發育模式是 long germ band，long germ band 指的是當胚原 (germ anlage) 形成時，各個部位已可對應到晚期胚胎的頭、胸、

腹部 (Roth, 2004)。然而其他昆蟲並非和 D. melanogaster 一樣都是屬於完全變態昆蟲或是 long germ band，所以其他昆蟲是否使用類似的體軸決定機制，仍是昆蟲發育生物學上的重要議題。隨著研究不同模式生物 Tribolium castaneum (赤擬穀盜) (完全變態昆蟲，short germ band 〔早期胚胎只有頭胸部，腹部需由 growth zone 一節一節生成〕)、Nasonia vitripennis (寄生蜂) (完全變態昆蟲，long germ band) 和 Gryllus bimaculatus (黃斑黑蟋蟀) (不完全變態，short germ band) 等體軸 決定機制發現，其他昆蟲所使用的基因不盡相同，以體軸前端決定為例：bicoid 基因目前只發現在高度演化的雙翅目中 (Lynch and Desplan, 2003; Fonseca et al., 2009)，故其他昆蟲是使用其他基因去決定體軸前端。在 T. castaneum 中，以 RNA interference (RNAi) 技術發現 orthodenticle (Tc-otd) 和 hunchback (Tc-hb) 的表 型 (phenotype) 與 D. melanogaster bicoid 突變型的表現類似，說明 Tc-otd 和 Tc-hb 的功能相當於 bicoid (Frohnhöfer and Nüsslein-Volhard, 1986; Berleth et al., 1988;

Schroder, 2003)；在 N. vitripennis 中也發現類似的實驗結果，otd 和 hb 基因的功 能相當於 bicoid (Pultz et al., 2005; Lynch et al., 2006)；G. bimaculatus 的 otd 基因表現會決定胚胎頭部的位置 (Nakamura et al., 2010)；Apis mellifera (蜜蜂) (完全變態昆蟲，long germ band) 的 otd-1、otd-2 和 hb 基因經 RNAi 技術處理後，將會影響胚胎前端結構的發育 (Wilson and Dearden, 2011)；在後端發育部分，相信是與 wingless/Wnt 訊號有關 (Martin and Kimelman, 2009; McGregor et al., 2009; Petersen and Reddien, 2009)，D. melanogaster 的 wingless 會表現在每個副節 (parasegment) 的後端，但不會影響體軸後端發育，然而在 short germ band 昆蟲 (G. bimaculatus

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和 T. castaneum) wingless mRNA 會表現在 growth zone，若以 RNAi 處理 Wnt 訊號相關的基因 (armadillo/β-catenin 和 wingless)，會出現後端發育不正常的情況 (Miyawaki et al., 2004; Ober and Jockusch, 2006; Bolognesi et al., 2008)，由 RNAi 結 果得知，wingless 能夠調控後端發育基因 caudal 的表現 (Shinmyo et al., 2005;

McGregor et al., 2009)，推論在 short germ band 昆蟲中，Wnt 訊號可以調控 caudal mRNA和體節以及後端發育，而這種模式在 long germ band 昆蟲中並非必要的 (Mito et al., 2010)。

Drosophila melanogaster 的背腹軸取決於 Gurken – EGFR 結合所產生的 EGF 訊號決定的，然而 gurken 基因的出現類似 bicoid 基因，gurken 的直系同源基因 (orthologs) 無法在雙翅目以外的昆蟲發現，目前認為 gurken 是由 tgfα-like 基因高 度特化而成 (Lynch et al., 2010; Lynch and Roth, 2011)，雖無法在其它昆蟲模式生物中發現 gurken 基因，但可以在 T. castaneum (Richards et al., 2008) 、 N.

vitripennis (Werren et al., 2010) 和 G. bimaculatus (Lynch et al., 2010) 中找到 tgfα- like 基因，由原位雜合、抗體染色和 RNAi 等技術的應用，得知 EGF 訊號會影響 卵細胞的位置和背腹極性以及濾泡細胞的分佈，除了卵細胞的極性外，在 T.

castaneum 和 N. vitripennis 的胚胎發育中，更可以明顯觀察到胚胎背腹軸的改變 (Lynch et al., 2010; Lynch and Roth, 2011)，經由這些實驗結果推論出一個假設：

在卵細胞發育時期中，卵細胞核的移動是產生 EGF 訊號的重要關鍵之一，當核移動至背腹側時，該側的濾泡細胞會有 EGF 訊號出現而決定為背側或腹側，卵細胞受精進入胚胎發育時，該側濾泡細胞提供背腹軸訊號給胚胎，決定胚胎的背腹軸，

此為一種生殖細胞 (卵細胞) 和體細胞 (濾泡細胞) 之間的訊號傳遞 (Lynch et al., 2010)。

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1.1.2 以豌豆蚜蟲 tgfα、EGFR 和 par-1 基因來研究其體軸決定機制

為了找尋演化發育生物學上重要議題的答案，原始昆蟲使用何種機制去決定前後和背腹體軸，而不同物種間的決定機制有何異同？此問題可藉由研究不同模式昆蟲去追尋答案，而本研究將著重在無性生殖豌豆蚜蟲的後端極性和背腹軸決定機制。

Acyrthosiphon pisum (豌豆蚜蟲) 是不完全變態的半翅目 (Hemiptera) 昆蟲，A.

pisum 不只是較為原始的昆蟲外 (相較於完全變態昆蟲)，其生活史具有兩種不同 的生殖模式—有性生殖和無性生殖。由春季至夏季，豌豆蚜蟲行孤雌胎生 (無性生殖) 以便於在寄主植物上產生大量子代，在這過程中若有出現食物短缺或環境擁擠時，會出現行無性生殖的有翅型，進入秋季後，因為日照時數減少等環境改變，使得行無性生殖的蚜蟲開始產生雄蟲以及行有性生殖的雌蟲，雄蟲和雌蟲交配後產下蛋，蛋會維持在滯育的狀態 (diapause) 直到過完冬季，到春季時，從蛋孵出來的蚜蟲均為行孤雌胎生的雌蟲，如此完成一年的生活史 (附錄一) (Miura et al., 2003)；在無性生殖中是以胎生的方式產出下一代，卵細胞發育完成後，緊接 著胚胎發育，兩者都在微卵管內完成，與一般有性生殖昆蟲不同，蚜蟲的卵和胚胎發育不論是在時間或是空間上都是連續的，對於卵的體軸如何影響胚胎的體軸有著更直接的證明。由過去實驗室成員黃廷宇的研究發現，其他昆蟲用來決定前端發育的 hb 和 otd 基因，只有 hb mRNA 會表現累積在 A. pisum 卵細胞前端，會持續到胚層 (blastoderm) 形成 (stage 5, 各個時期說明參照 Miura et al., 2003)，此現象是類似於 bicoid 基因在D. melanogaster 卵細胞前端表現；在卵細胞發育時期無法偵測到 otd mRNA 表現，說明 hb 基因在A. pisum 無性生殖中仍具有決定前端的特性，而 otd 基因則不一定 (Huang et al., 2010)；相較於前端有前後體軸決定基因的聚集，至今仍沒有找到後端的體軸決定基因的聚集 (實驗室過去研究無法偵測

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到 wingless 和 caudal mRNA 在卵發育時期的表現)，為了找出 A. pisum 無性生殖中前後體軸決定的機制，將研究在其它模式生物的卵和胚胎後端累積的基因 par- 1 作為碩士班研究的題目之一，希望能藉由原位雜合和抗體免疫染色的方式，觀 察 par-1 mRNA 和蛋白質是否會在卵發育時期累積在後端，進一步證明 Par-1 蛋白質在後端決定機制裡，是否有相當保守的功能。

另一方面，本研究也涉足到過去無人在 A. pisum 探討的問題，卵發育時期中背腹軸是何時決定以及如何決定的？由過去文獻指出，在 A. pisum 無性生殖的卵發育早期，卵細胞核有移動至背腹側的現象 (Riparbelli et al., 2005)，該現象在不同模式昆蟲中也有發現 (Lynch et al., 2010)，連同 EGF 訊號都被認為是與胚胎背腹軸有關聯，結合這些線索和觀察，決定以 tgfα、EGFR 和 EGF 訊號下游的分子，

去檢視該背腹軸決定機制是否在各個昆蟲中均為保守？同時希望能藉由其結果，

確認 A. pisum 無性生殖中背腹軸是在哪個時期決定的？

1.2 眼部特化

1.2.1 模式生物的眼部特化機制

在動物界 (animal kingdom) 中有各式各樣的眼睛，其中節肢動物的眼睛構造稱為複眼 (compound eye)，各個複眼的構造、組成以及成像原理有些許差異，過去也以此去做為討論複眼演化的共通性 (Nilsson, 1996; Fernald, 2000)，目前相信現在所有節肢動物的複眼是源至於同一個起源 (Paulus, 1979; Melzer et al., 1999)，

複眼的分子遺傳研究是起源於模式生物 Drosophila melanogaster，D. melanogaster 是完全變態昆蟲，代表幼蟲需要經過蛹的階段才變成成蟲，成蟲的構造將會與幼蟲不同，幼蟲的視覺構造稱為 Bolwig’s organ，由胚胎發育過程決定；成蟲的視覺構造為複眼，由外胚層 (ectoderm) 形成成蟲盤 (imaginal discs)，至二齡幼蟲時，

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成蟲盤細胞開始迅速分裂但不分化，直到三齡時，出現型態溝 (morphogenetic furrow) 一條直線波狀結構在成蟲盤上由後往前移動，經過之細胞將會重新排列而形成未來的小眼 (為構成複眼的最小構造)，使細胞開始分化成複眼 (Ready et al., 1976;Younossi-Haryenstein et al., 1993)；不完全變態昆蟲的幼蟲和成蟲的視覺構造 均為複眼，是在胚胎時期便特化的，然而每次蛻皮時複眼結構將會增生 (Callaerts et al., 2006)。許多研究以指出早期眼部發育分別由數個關鍵基因調控，先由兩個 Pax6 基因 eyeless (ey) 和 twin of eyeless (toy) 調控眼部的特化，經過特化之後，由 eyes absent (eya)、sine oculis (so)、dachshund (dac) 和 eyegone (eyg) 等基因連同 ey 和 toy 的表現去決定眼部細胞的命運，這些基因統稱為 Retinal determination genes (RD genes)，而這些基因彼此調控所構成的關係又稱為 Retinal determination genes net work (RDGN) (Silver and Rebay, 2005; Callaerts et al., 2006; Friedrich, 2006)，接 著介紹數個與本研究有關的 RD genes 在眼睛發育所扮演的角色。

D. melanogaster 最早發現與眼部特化有關的基因，其中之一是 ey 和 toy 基因，

ey 和 toy 基因是脊椎動物 Pax6 的同源基因 (homolog) (Quiring et al., 1994; Czerny et al., 1999)，Pax6 基因是屬於 Pax 家族成員之一，為具有與功能區塊 pair domain 和 homeodomain (均能與 DNA binding) 的轉錄因子 (Callaerts et al., 1997)，Pax6 在動物界中已被證實與眼部發育有關 (Gehring and Ikeo, 1999)。已知 ey 和 toy mRNA 會表現在 D. melanogaster 胚胎的頭部外胚層，特別是在頭前葉 (procephalic lobe) 包含視葉原基 (optic lobe primordia)，以及眼部成蟲盤 (eye imaginal disc) 和腹神經索 (ventral nerve cord)，在眼部成蟲盤上未分化的細胞 ey 和 toy 表現高於已分化細胞，而異位表現 ey 和 toy 將會導致長出異位複眼 (Quiring et al., 1994; Czerny et al., 1999)。然而這兩個 Pax6 基因仍是有差異的，

toy 表現在頭前葉的時間點是早於 ey 的表現，且在 ey 突變的胚胎仍可偵測到 toy

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表現在視葉原基，用 Gal4-UAS 系統得知：異位表現 toy 的位置同樣可以偵測到 ey 的表現；異位表現 ey 的位置卻沒有 toy 的表現。結合這些資料可知 toy 是位於 ey 上游的基因，同時可以調控 ey 的表現 (藉由 Toy 結合至 ey 的 eye-specific enhancer)，但在 ey 突變下，異位表現 toy 並無法導致異位複眼的出現。在其它無 脊椎動物如 P. mammillata (海鞘)、Branchiostoma floridae (文昌魚)、Canorhabditis elegans 的 Pax6 基因 (C. elegans 為 vab-3) 都會表現在頭部外胚層，其中的一部分 將會特化成眼部 (Chisholm and Horvitz, 1995; Glardon et al., 1997,1998)。

除了倚賴 ey 和 toy 的表現來完成眼部的特化外，還需要其他基因如 eya、so 等協助決定眼部細胞的命運。Eya 蛋白序列上含有兩個區塊 (Eya domain-1 and -2) 以及 PEST region (proline/serine/threonine rich)，Eya domain 功能在於和 So 和 Dac 接合來影響 RDGN 下游基因的表現 (Chen et al., 1997; Pignoni et al., 1997; Bonini et al., 1998)；So 為 Six 家族成員之一，其蛋白序列上有兩個區塊 Six domain 和 homeodomain，Six domain 是與 Eya domain 作用的主要區塊 (Silver and Rebay, 2005)，Eya 和 So 已確定與組織特化、增生和存活等有密切的關係 (Silver and Rebay, 2005)，兩者均會表現在眼部成蟲盤 (特別在型態溝的前後)、幼蟲視覺系統以及視葉發育，其中 eya 在眼部成蟲盤的表現會早於 so 的表現 (Kenyon et al., 2003)，兩者的突變將會致死或是出現沒有複眼的表型，由這些表型推斷出 eya 和 so 在型態溝分化細胞的過程扮演重要的角色 (Bonini et al., 1993, 1998; Cheyette et al., 1994; Halder et al., 1998; Daniel et al., 1999; Zimmerman et al., 2000)，異位表現 eya 會導致異位複眼，但其出現頻率和程度均小於異位表現 ey 的結果 (Bonini et al., 1997; Pignoni et al., 1997)。在 eya 突變的眼部成蟲盤是無法偵測到 so 的表現，

可以偵測到 ey 的表現；so 突變的眼部成蟲盤卻是可以偵測到 eya 和 ey 的表現；

ey 突變的眼部成蟲盤無法偵測到 eya 和 so 的表現 (Halder et al., 1998)，由此可知，

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eya 和 so 是位於 RDGN 中 ey 的下游基因。

D. melanogaster 中發現另一個眼部特化有關的基因 eyg，eyg 同樣含有功能區 塊 pair domain 和 homeodomain，因此被視為另一個 Pax 基因，然而其 pair domain 相較於 ey 和 toy 的 pair domain 是有部分消失的，即便如此在 eyg 的突變型中可發現沒有複眼的表型，以及眼部成蟲盤上沒有光感受細胞的分化 (Hazelett et al., 1998)，這現象相信是與 wingless 基因有關，在 eyg 突變的眼部成蟲盤上可發現 wingless 會表現在成蟲盤後緣，而目前已知 wingless 會抑制型態溝的出現 (Ma and Moses 1995; Treisman and Rubin 1995)，當在成蟲盤後緣抑制 wingless 訊號表現時，

可觀察到成蟲盤上的光感受細胞開始分化，故 eyg 在眼部發育的功能可能是作為一個調控 wingless 表現的基因 (Hazelett et al., 1998)。eyg 的異位表現無法在眼部成蟲盤以外的組織上，促使異位複眼產生，但同時異位表現 eyg 和 ey 時，會明顯的增加異位複眼的大小和頻率，推測 eyg 雖與眼部發育有關，但採取的調控機制似乎與 ey 等基因不同 (Jang et al., 2003)，目前還需更多的證據去證明與其他 RD genes 的關係是如何。

1.2.2 以豌豆蚜蟲 toy、eya 和 eyg 基因來研究其眼部特化

過去眼部發育的研究主要是集中在 D. melanogaster 中，而其複眼發育是來自於眼部成蟲盤，但這構造並不存在於不完全變態昆蟲中，不完全變態昆蟲的複眼是由胚胎發育過程中特化的，目前對於不完全變態昆蟲的眼部發育研究甚少，無從得知其發育的機制是否與完全變態昆蟲相似抑或是不同？選擇 A. pisum 進行眼部發育的研究，除了進一步了解不完全變態昆蟲的眼部發育機制外，A. pisum 具有非遺傳多型性 (polyphenism) 的特性，在環境因子的刺激下，A. pisum 會出現有翅型，相較於無翅型，其小眼數量較多且有單眼結構 (Kalmus, 1945; Kring 1977;

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Kawada, 1987; Braendle et al., 2006)，眼部發育研究在日後或許能幫助了解環境因 子是否會在胚胎發育過程中，影響眼部特化基因進一步影響複眼大小和有無單眼，

此外也希望能藉由這些 RD genes 正確標出在胚胎發育過程中，A. pisum 眼部結構的位置和可能出現的時期，因為 A. pisum 的發育時期雖被分析和描述 (Miura et al., 2003)，但對於細節的發育仍是處在不明的狀態，所以將採取以選殖這些高度保守的 RD genes，並在胚胎發育中觀察其表現，以便於回答蚜蟲是如何進行眼部特化，

以其機制是否與其他昆蟲類似，並以其器官生成來進一步探討以前未發現的細部發育。

(20)

第二章實驗材料與方法

2.1 豌豆蚜蟲的飼養

本實驗室所用的豌豆蚜蟲 Acyrthosiphon pisum 是取至於中興大學郭美華教授的實驗室，豌豆蚜蟲是放置於健康的豌豆植株 (Pisum sativum) 上飼養，而植株種植是將豌豆種子淺埋至培養土中，並澆灑適量的水後放在培養箱待其發芽，培養箱環境條件等同於蚜蟲飼養條件，溫度為攝氏 20 度並維持 16 小時亮 8 小時暗的光週期。當豌豆植株長至約 10~12 公分時，移入 1000 ml 燒杯中，即可將蚜蟲移至植株上並且覆蓋上細網 (以橡皮筋固定) 以確保蚜蟲不會逃出燒杯，之後每天固定澆灑少量的水，當移入蚜蟲後 1~2 禮拜，便需種植另一盆豌豆以免植物枯萎而使蚜蟲餓死。

2.2 合成探針

2.2.1 萃取 total RNA 和反轉錄

從培養植物上取三齡以上的豌豆蚜蟲約 10~25 mg (20~50 隻左右)，放入微量離心管內並以液態氮急速冷凍。取 400 µl RB Buffer (Geneaid) 與 4 µl β - mercaptoethanol 混合，分兩次注入含蚜蟲的離心管內，第一次加入混合液 (202 µl) 後，以滅過菌的 micropestle 裝在 pellet pestle (Sigma-Aldrich) 上並加以攪拌數次，

取出 micropestle 並加入剩餘的混合液，放置室溫 5 分鐘。將 Filter Column (Geneaid) 裝在 2 ml Collection Tube (Geneaid) 並加混合液到 Filter Column 中，以 1000 x g 離心 1 分鐘，去除 Filter Column，加 400 µl 70% ethanol 到濾液中並搖晃混合均勻。將RB Column (Geneaid) 裝在 2 ml Collection Tube 並加混合液到 RB Column 中，以 16000 x g 離心 2 分鐘，去除濾液。加 400 µl W1 Buffer (Geneaid)

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到 RB Column 中，以 16000 x g 離心 1 分鐘，去除濾液。加 600 µl Wash Buffer (Geneaid) 到 RB Column 中，以 16000 x g 離心 1 分鐘，去除濾液，重複加入 Wash Buffer 並離心去除濾液，以 16000 x g 離心 3 分鐘來脫乾。將 RB Column 裝在微量離心管上，加入 50 µl RNase-free water (Geneaid) 到 RB Column 膜中心，室溫下靜置 3 分鐘，以 16000 x g 離心 1 分鐘。以光度計 (eppendorf biophotometer) 測濾液中 RNA 濃度，並以 RNA gel 電泳確認 RNA 降解程度後，將濾液保存在 - 80°C 冰箱中。

製作 1片 RNA gel (1.2%) 是取 20.25 ml 二次水和 0.3 g agarose (Bioman) 並在血清瓶內混合，以微波爐小心地微波加熱，注意瓶蓋鬆緊以避免瓶內外壓力差使得瓶身破裂，待其溶液呈現透明澄清時，稍微靜置冷卻，加入 2.5 ml 10× MOPS 和 1.5 ml 20% paraformaldehyde 並混合均勻，倒入鑄膠器中，去除液體中的氣泡並差上齒梳，在通風的環境下靜置約 1 小時，即可使用。將進行 RNA gel 電泳的樣品，需取 2 µl RNA、1 µl 10× MOPS、4 µl 20% paraformaldehyde、5 µl formamide、2 µl EtBr (200 µg / ml) 和 1 µl 6× sample dye (Bioman) 到微量離心管中混合均勻，在 85°C 加熱 10 分鐘，靜置在 4°C 10分鐘即可。先在 RNA 電泳槽中倒入 1× MOPS 並放好 RNA gel，將處理好的 RNA 樣品加到 RNA gel 的孔洞中，

並以 50 Voltage 進行 1 小時，用電泳照膠系統 (Major science DI-01) 拍照。

在微量離心管中加入 6 µl total RNA (≤ 5 µg)、4 µl 2.5 mM dNTPs (Bioman)、2 µl 25 µM oligo dT18 primer (5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTT –3’)，混合均勻後加熱到 65°C 5分鐘，放在冰上 1 分鐘，再加入 4 µl 5× First-Strand Buffer (Bionovas)、2 µl 0.1 M DTT (Bionovas)、1 µl RNase inhibitor (40 U / µl, Invitrogen) 和 1 µl HiScript I Reverse Transcriptase (Bionovas)，混合均勻後，加熱到 42°C 60 分鐘，加熱到 70°C 15分鐘，放在 -20°C 冰箱保存。

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2.2.2 設計專一性引子

由於豌豆蚜蟲 Acyrthosiphon pisum 的基因體在 2010 年時被解序了 (the international aphid genomics consortium, 2010)，其資料庫 aphidbase 也被釋出供人查詢 (http://www.aphidbase.com/aphidbase/)，此研究計畫中所研究的基因，是先由其他模式昆蟲如 Drosophila melanogaster、Tribolium castaneum、Apis mellifera 和 Nasonia vitripennis 的已知相關基因序列，在 aphidbase 上進行 Blastp 並拿積分最 高的前 20 項序列，至 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 以 reciprocal Blastp 的方式，看能否對應到各物種的目標基因，同時也參照其他豌豆蚜蟲發育基因相關文獻 (Shigenobu et al., 2010) 來確認基因是否正確，取得蚜蟲的目標基因後，以生物資訊軟體 MacVector 中的 primer design 功能來設計各個基因的專一性引子，引子的選擇盡量以包含保守和非保守區段為主。下為本研究所用到的各基因的專一性引子 (F 為 forward; R 為 reverse)：

Aptoy_F138：5'- CGAACCATTTTGGAAGATGCCTC -3' Aptoy_R589：5'- TGTTGTCGTTGCTACACACCCC -3' Apeya_F2295：5'- CGAAACCATCATCGTGTTCAACTC -3' Apeya_R2614：5'- ACGCCAACTTCCTCATCCAGTC -3' Apeyg_F73：5'- CTGATTGGTGGAAGCAAACCC -3' Apeyg_R753：5'- TTCGGACAAACTGGTCTTGGC -3' ApEGFR_F2540：5'- TGATTCTTGTATGGCACTGGCG -3' ApEGFR_R3212：5'- CATTTCACAGGCATCTTTCCACC -3' Aptgfα_F1：5'- ATGTCGAAAAGGACGCTGAGAAACC -3' Aptgfα_R863：5'- ACGATCAAAGGTTCTTGTCGCGAA -3'

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Appar-1_F1858：5’- CAAGATTTCAAAGAACCAAAACG -3’

Appar-1_R2877：5’- AAACTTGGATGATATTTTTGAAAAG -3’

2.2.3 PCR 操作和產物回收

準備數管 PCR tube，除了所需的管數外，還需要包含 positive control 和 negative control，各個PCR tube 內需有 6.1 µl ddH2O、1 µl 10× PCR buffer (Bioman)、1 µl 2.5 mM dNTPs (Bioman)、0.1 µl BioTaq DNA polymerase (Bioman)、

0.4 µl 25 µM gene specific forward primer、0.4 µl 25 µM gene specific reverse primer 和 1 µl cDNA (0.1 µg) ； positive control 使用的 primer 為 actin_F84 (5'- AATCCTgTTgACCgAAgCCC -3') 和 actin_R532 (5'- TTCCgATggTgATgACCTgTCC -3') ；negative control 則是不加入 cDNA。放入 PCR machine (Applied Biosystems) 中執行下列的工作：(1) 94°C 處理 5 分鐘，(2) 94°C 處理 30 秒，(3) 45-60°C 處理 30秒，(4) 70°C 處理 0.5~1.5 分鐘，(5) 重複步驟 (2)~(4) 39 次，(6) 70°C 處理 10 分鐘，(7) 10°C 保存。若為第一次使用的 primer，則需在步驟 (3) 中測試適合的 annealing temperature (45~60°C)，步驟 (4) 中的時間是以目標片端的大小而定：0.5 kb 則用 30 秒，1 kb 用 1 分鐘，1.5 kb 用 1.5 分鐘。以 DNA agarose gel (2%) 進行 DNA 電泳，每個樣品取 3 µl 並加上 1 µl 6× sample dye (Bioman)，以 80 V 執行 35 分鐘，用電泳照膠系統 (Major science DI-01) 拍照。

製作 1片 DNA gel (2%) 是取 15 ml 1× TAE buffer (Bioman) 和 0.3 g agarose (Bioman) 並在血清瓶內混合，以微波爐小心地微波加熱，注意瓶蓋鬆緊以避免瓶內外壓力差使得瓶身破裂，待其溶液呈現透明澄清時，稍微靜置冷卻，加入 0.75 µl EtBr (0.625 mg / ml，aMRESCO) 並混合均勻，倒入鑄膠器中，去除液體中的氣

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泡並差上齒梳，在通風的環境下靜置約 1 小時，即可使用。先在 DNA 電泳槽中倒入 1× TAE buffer 並放好 DNA gel，將 DNA 樣品 (需加上適量的 6× sample dye) 加到 DNA gel 的孔洞中，並以 80 Voltage 進行 40 分鐘，用電泳照膠系統 (Major science DI-01) 拍照。

確定好適合的條件後，再做一次大量的 PCR 操作，並且做完 DNA 電泳後，

將含有 PCR 產物的膠體放在 UV 箱上，做好防護措施後打開 UV 光，先確認片段大小是否正確，然後用刀片將該區塊切下來並放到微量離心管內，加 500 µl PG Buffer (Bioman) 後混合均勻，加熱到 55°C 15分鐘，過程中每 3 分鐘就混勻一次，

將 Spin Column (Bioman)裝在 Collection Tube (Bioman) 上，將膠體溶液移至 Spin Column 中並以 6000 x g 離心 30 秒，去除濾液。加 500 µl Wash Buffer (Bioman) 並以 6000 x g 離心 30 秒，去除濾液，以 16000 x g 離心 2 分鐘，將 Spin Column 裝在微量離心管上，加 15 µl Elution Buffer (Bioman) 到 Spin Column 膜中央，靜置 2 分鐘，以 16000 x g 離心 2 分鐘，放在 -20°C 冰箱保存。

2.2.4 接合反應和轉型

接合反應中載體和 DNA 片段的 molecular ration 固定為 1：3。取 1 µl 10×

Rapid ligation buffer (New England BioLabs)、6 µl PCR product (由 2.2.3 方法回收的產物)、2 µl T&A vector (25 ng / µl, RBC Bioscience)、1 µl T4 ligase (New England BioLabs) 到微量離心管中，充分均勻混合後，放置於 4°C 冰箱過夜。

加 2 µl 接合反應的產物到 50 µl HIT E. coli competent cells (JM109, RBC Bioscience)，以輕微震盪 1 秒鐘來混合，放置於冰上 10 分鐘，另混合 14 µl 20%

IPTG 和 80 µl X-gal 來準備進行藍白篩選。取兩盤 LB agar 培養皿 (含 ampicillin) 並放在室溫回溫後，先在其中一盤上加上 47 µl IPTG 和 X-gal 混合液，然後加上

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35 µl 轉型 JM109 cells，用玻璃棒使菌液塗勻；另一盤同樣加上47 µl IPTG 和 X- gal 混合液，然後加上 15 µl 轉型 JM109 cells，用玻璃棒使菌液塗勻。完成後，放入 37°C 培養箱中培養 12~14 小時。

進行藍白篩選前，準備至少 10 管 PCR tube，內含有 7.1 µl ddH2O、1 µl 10×

PCR buffer (Bioman) 、 1 µl 2.5 mM dNTPs (Bioman) 、 0.1 µl BioTaq DNA polymerase (Bioman) 、 0.4 µl 25 µM M13 forward primer (5'- GTTTTCCCAGTCACGAC -3') 、 0.4 µl 25 µM M13 reverse primer (5'- TCACACAGGAAACAGCTATGAC -3')。以微量吸管尖去挑選白色單一菌落，在 PCR tube 中攪拌至少 50 次，以同樣的微量吸管尖在新的培養皿上塗劃，重覆挑選別的白色單一菌落並塗盤直到 PCR tube 都含有菌體 (需留一管作為 negative control)，放入 PCR machine (Applied Biosystems) 中執行下列的工作：(1) 94°C 處理 5 分鐘，(2) 94°C 處理 30 秒，(3) 55°C 處理 30秒，(4) 70°C 處理 1~1.5 分鐘，

(5) 重覆步驟 (2)~(4) 39 次，(6) 70°C 處理 10 分鐘，(7) 10°C 保存。以 DNA agarose gel (2%) 進行 DNA 電泳，每個樣品取 3 µl 並加上 1 µl 6× sample dye (Bioman)，以 80 V 執行 35 分鐘，用電泳照膠系統 (Major science DI-01) 拍照。挑選符合預計大小片段 DNA 的菌落，送至生技公司加以定序，以生物資訊軟體 MacVector判斷是否為目標基因的序列，若正確無誤則萃取該質體並用 PCR 放大該片段，接上另一個載體 pGEM-T easy (Promega)，方法如下：取 5 µl 2× Rapid ligation buffer (Promega)、3 µl PCR product、1 µl pGEM-T easy vector (50 ng / µl, Promega)、1 µl T4 ligase (Promega) 到微量離心管中，充分均勻混合後，放置於 4°C 冰箱過夜。後續步驟同第二段，惟藍白篩選所用的 PCR primer 不同，改用 0.4 µl 25 µM T7 primer (5'- TAATACGACTCACTATAGGG -3') 和 0.4 µl 25 µM Sp6 primer (5'- AGCTATTTAGGTGACACTATAG -3')，最後同樣挑選符合預計大小片

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段 DNA 的菌落，送至生技公司加以定序，進行第二次檢查。

2.2.5 養菌和質體萃取

準備含有 3~10 ml LB medium (Luria-Bertani medium) 的離心管 (LB medium 體積不超過離心管體積的 30%，以免影響氧氣的含量)，加入適量的 ampicillin (50 mg / µl) 使最終濃度為 100 mg / µl ampicillin，以微量吸管尖挑選出單一菌落並置入於 LB medium 中，同時將新的微量吸管尖放入另一 LB medium 當做 negative control。以膠帶固定蓋子，使之不脫落並能讓氣體流通，將各個離心管放入迴轉式震盪培養箱 (TKS OSI500R) 中，以 240 rpm 在 37°C 培養 12~14 小時。培養完後，取 500 µl 菌液加到含有 500 µl 60% glycerol 微量離心管中，以震盪來混合均勻後，放入液態氮中急速冷凍，保存至 -80°C 冰箱。

取 1~3 ml 菌液，加到微量離心管中，並以 13000 x g 離心 1 分鐘，去除上清液，在含有菌體沈澱物的離心管中加入 200 µl P1 Buffer (Genomics) 並充分混合，

加入 200 µl P2 Buffer (Genomics)，溫和地翻轉 10~20 次，加入 300 µl P3 Buffer (Genomics) 並馬上溫和地翻轉 10~20 次，以 13000 x g 離心 10 分鐘，取上清液移到另一管微量離心管中，再以 13000 x g 離心 10 分鐘，確保沒有白色沈澱物漂浮。

將上清液移到 GP3 column (Genomics)，以 13000 x g 離心 1 分鐘，去除濾液。在 GP3 column 中加入 500 µl PD Buffer (Genomics)，以 13000 x g 離心 1 分鐘，去除濾液。在 GP3 column 中加入 500 µl PW Buffer (Genomics)，以 13000 x g 離心 1 分鐘，去除濾液。以13000 x g 空管離心 2 分鐘，開蓋並放置室溫下 15 分鐘以上，

將 GP3 column 移至新的微量離心管上，加 100 µl EB Buffer (Genomics) 並放置室溫 2 分鐘，以13000 x g 離心 1 分鐘，去除 GP3 column，以光度計 (eppendorf biophotometer) 測濾液中質體濃度，並以 1% DNA gel電泳確認質體情況後，將微

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量離心管放到 -20°C 冰箱保存。

2.2.6 限制酶處理

將含有目標基因序列的載體 pGEM-T easy 送至生技公司加以定序，並以生物資訊軟體 MacVector確定目標基因的序列和方向以及限制酶切位是否正確，若需轉錄的序列與 T7 promoter 同向，則以 SpeI 限制酶去處理質體，以作為之後反義股探針 (antisense probe) 的模板，另以 NcoI 限制酶去處理質體，以作為之後義股探針 (sense probe) 的模板；若需轉錄的序列與 SP6 promoter 同向，則使用的限制酶正好相反。

確認質體濃度後，取 2 µg 質體至微量離心管中，並加入 8 µl NEBuffer 4 (New England BioLabs)，加入 1 µl NcoI or SpeI (10000 U / ml, New England BioLabs) (若使用 SpeI 則需另加入 0.8 µl 100 µg / ml BSA)，剩下以二次水加至總體積為 80 µl 並且混合均勻，放入 37°C 培養箱中反應 4~4.5 小時，取 3 µl 混合液去做 DNA 電泳 (1% DNA agarose gel)，同時用1 µl 質體當positive control，確認質體已被限制酶處理成 linear form，即可接續 DNA 沈澱的步驟。

2.2.7 DNA 沈澱

估算要進行 DNA 沈澱的液體體積，加入 1/10 倍體積的 3 M sodium acetate (pH 5.2)，加入 2 倍體積的 99% (v/v) ethanol (-15~-25°C) 並混合均勻，放入 -80°C 冰箱 30 分鐘以上，在 4°C 以 13000 x g 離心 10 分鐘，去除上清液，加 50 µl 70%

(v/v) ethanol (4°C) 並混合均勻，在 4°C 以 13000 x g 離心 5 分鐘，去除上清液，

加 50 µl 70% ethanol (4°C) 並混合均勻，在 4°C 以 13000 x g 離心 5 分鐘，去除上清液，開蓋子放室溫下數分鐘以移除 ethanol，加 25 µl 二次水回溶，保存至 -20°C 冰箱。

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2.2.8 胞外轉錄 (in vitro transcription)

取 6.75 µl 限制酶處理過的質體 (NcoI / SpeI cut plasmid, 100~400 ng) 到微量離心管中，加 1 µl 10× RNA polymerase buffer (New England BioLabs)、0.25 µl RNase inhibitor (40 U / µl, Invitrogen)、1 µl 10× DIG/Fluorescein RNA labeling mix (Roche) 和 1 µl T7 polymerase (50000 U / ml, New England BioLabs) / SP6 polymerase (20000 U / ml, New England BioLabs)，總體積為 10 µl 並混合均勻，放入 37°C 培養箱中反應 4 小時，加入 1 µl 0.2 M EDTA (pH 8.0) 來中止反應，接著緊接著 RNA 沈澱的步驟。

2.2.9 RNA 沈澱

估算要進行 RNA 沈澱的液體體積，加入 1/10 倍體積的 3 M sodium acetate (pH 5.2)，加入 2.5 倍體積的 99% (v/v) ethanol (-15~-25°C) 並混合均勻，放入 - 80°C 冰箱 30 分鐘以上，在 4°C 以 13000 x g 離心 20 分鐘，去除上清液，加 50 µl 70% (v/v) ethanol (4°C) 並混合均勻，在 4°C 以 13000 x g 離心 3 分鐘，去除上清液，加 50 µl 70% ethanol (4°C) 並混合均勻，在 4°C 以 13000 x g 離心 3 分鐘，去除上清液，開蓋子放室溫下數分鐘以移除 ethanol ，同時加熱含 diethyl pyrocarbonate (DEPC) 二次水到 37°C，加 50 µl DEPC 二次水到含 RNA 沈澱的微量離心管中，加熱到 37°C 15 分鐘，然後以光度計 (eppendorf biophotometer) 測其中 riboprobe 濃度，並以 RNA gel 電泳確認 riboprobe 情況，將液體保存在 -80°C 冰箱中，若需長期保存，則可以加入同體積的 hybridization buffer (50% formamide, 5× sodium chloride / sodium citrate, 0.1% Tween-20) 後放入 -80°C 冰箱中保存。

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2.3. 原位雜合反應

2.3.1 解剖豌豆蚜蟲

從豌豆 Pisum sativum 上取 4 齡以上的豌豆蚜蟲 Acyrthosiphon pisum 移到培養皿中。準備新鮮的 20% paraformaldehyde，以 1× phosphate-buffered saline (PBS) 稀釋成 4% paraformaldehyde / PBS。加 4% paraformaldehyde / PBS 到解剖盤上，

將蚜蟲放入 4% paraformaldehyde / PBS 中解剖，先去除胸節上的六足，接著用鑷子固定腹部末端，用另一隻鑷子從腹部側面撕開蚜蟲，即可看到成串的微卵管，

接著去除粘附的體壁組織和消化道，收集 2~4 隻蚜蟲的微卵管後用微量吸管吸起，

移到含有少量 4% paraformaldehyde / PBS 的微量離心管中，整個過程微卵管都不可以離開液面，以免造成互相纏繞而影響原位雜合的效果。加入同體積的 heptane 並用旋轉震盪混合器 (interlli mix RM-2, Elmi) 在室溫下持續旋轉 4 小時或在 4°C 放隔夜，去除下層 4% paraformaldehyde / PBS，加入同體積的 methanol 旋轉 5 分鐘，去除大部分液體。加 700 µl methanol 旋轉 5 分鐘，去除 methanol，重覆此步驟 2 次，加 700 µl methanol 後，保存於 -20°C 冰箱中。

2.3.2 原位雜合反應

先使存放 -20°C 已脫過水的微卵管再度水合，以 methanol 和 1× phosphate- buffered saline (PBS) 分別配製出 3：1、1：1 和 1：3 比例溶液，加入 500 µl 各比例溶液並旋轉 5 分鐘，去除該溶液並重覆此步驟 (去除溶液時，仍須保留約 50~100 µl 溶液，避免微卵管離開液面)，以 700 µl 0.1% PTw （1× PBS，0.1%

Tween-20）重覆清洗 4 次，每次旋轉 5 分鐘。加 500 µl hybridization buffer - (Hyb-) (50% formamide，5× sodium chloride / sodium citrate (SSC)，0.1% Tween- 20)，並放入雜合烘箱中 (hybridization oven, YIH DER RH-800) 在 68°C 震盪 10 分

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鐘，同時準備 hybridization buffer + (Hyb+) (50% formamide，5× sodium chloride / sodium citrate (SSC)，0.1% Tween-20，5 mg / ml yeast RNA，50 µg / ml heparin) 加熱至 68°C，去除 Hyb- 並加入 500 µl Hyb+ 在 60~72°C (溫度需經多次調整至呈色效果最好的溫度) 震盪 2~5 小時，同時準備目標基因的探針 (antisense 和 sense riboprobe，0.2 µg / 200 µl Hyb+ )，分別加入 200 µl 探針並在 60~72°C震盪至隔夜 (至少 16 小時)。去除溶液並以 500 µl Hyb- 在相同的溫度 (60~72°C) 下震盪 7 分鐘後去除溶液，以 Hyb- 和 2× SSC 配製出 3：1、1：1 和 1：3 比例溶液，加入 500 µl 各比例溶液並在相同的溫度下震盪 7 分鐘，去除該溶液並重覆此步驟，加 500 µl 2× SSC 並在相同的溫度下震盪 0.5~1 小時，去除溶液後加入 500 µl 0.2× SSC 並在相同的溫度下震盪 0.5~1 小時，去除溶液並重覆加入 0.2× SSC 此步驟 1 次。去除溶液後，加入 700 µl 1× DIG washing buffer (MNT) (150 mM maleic acid，100 mM NaCl，0.1% Tween-20；pH 7.5) 在室溫下旋轉 10 分鐘後去除溶液，加入 200 µl 1× blocking buffer (DIG wash and blocking buffer set，Roche) 在室溫下旋轉 0.5~2.5 小時，去除溶液，加入200 µl anti digoxigenin (DIG) antibody / fluorescein (FL) antibody (DIG / FL-alkaline phosphatase (AP) Fab fragment (Roche) 以 1×

blocking buffer 稀釋 1000 倍) 在室溫下旋轉 2~4 小時或 4°C 震盪至隔夜，去除溶液，加入 700 µl MNT 在室溫下旋轉 15~20 分鐘，去除溶液，重覆加入 MNT 此步驟 2 次，加入 700 µl TBST (Tris-buffered saline，0.1% Tween-20) 在室溫下旋轉 5~10 分鐘，去除溶液，重覆加入 TBST 此步驟 1 次，加入 700 µl 含 1 mM levamisole (Sigma) TBST 在室溫下旋轉 5~10 分鐘，去除溶液，加入 700 µl 1×

detection buffer (100 mM Tris-Cl，100 mM NaCl，500 mM MgCl2，0.1% Tween-20，

1 mM levamisole；pH 9.5) 在室溫下旋轉 5~10 分鐘，去除溶液，重覆加入 1×

detection buffer 此步驟 2 次。準備 AP substrates，加 20 µl NBT/BCIP stock solution

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(Nitroblue tetrazolium (NBT) 18.75 mg / ml，5-bromo-4-choro-3-indolyl phosphate (BCIP) 9.4 mg / ml，Roche) 到 1 ml 1× detection buffer (含 1 mM levamisole)，將微卵管以微量吸管移到玻璃解剖盤，加上 200 µl AP substrates (NBT/BCIP)，放在 4°C 冰箱呈色，每小時觀察一次。呈色完成後，紀錄呈色時間並加 0.1% PTw 來中止呈色反應，並將微卵管移回原本的微量離心管，加 700 µl 0.1% PTw 在室溫下旋轉 10 分鐘，去除溶液，重覆加入 0.1% PTw 此步驟 2 次。將 1000× 4’,6- diamidino-2-phenylindole (DAPI，2 ng / µl) (Sigma) 以 0.1% PTw 稀釋成 1× DAPI，

加 500 µl 1× DAPI 在室溫下旋轉 1 小時或 4°C 震盪至隔夜 (加入 1× DAPI 之後的步驟都需要避光)，去除溶液，加 700 µl 0.1% PTw 在室溫下旋轉 10 分鐘，去除溶液，重覆加入 0.1% PTw 此步驟 3 次。加入 500 µl 70% glycerol，以鋁箔紙或紙盒保管避免光線，放入 4°C 冰箱震盪至隔夜，保存在 4°C 冰箱。

若要進行雙原位雜合反應 (double in situ hybridization)，在探針雜合時，就需將兩種不同標誌的探針 (DIG / FL labeling probe) 放入同一管 Hyb+ 中，後續步驟相同，到呈完色後用 0.1% PTw 室溫下洗 4 次，加入 700 µl 0.1 M glycine-HCl (pH 2.2，含 0.1% Tween-20) 在室溫下旋轉 10 分鐘，去除溶液，再加入 200 µl 1×

blocking buffer 在室溫下旋轉0.5~2.5 小時，加 200 µl anti FL alkaline phosphatase (以 1× blocking buffer 稀釋 1000 倍) 在室溫下旋轉 2~4 小時或 4°C 震盪至隔夜，

去除溶液，後續步驟從加入 MNT 開始與原位雜合相同。若要使用 Fast red (Roche) 或 Fast blue (Sigma) 去呈色時，注意使用的 1× detection buffer 是不同的，Fast red 是用一顆 Fast red tablet (Roche) 溶在 2 ml 1× detection buffer (0.1 M Tris-HCl，

0.1% Tween-20 ， 1 mM levamisole ， pH 8.2) ；取 20 µl 4-benzoylamino-2,5- diethoxybenzenediazonium chloride hemi[zinc chloride] (Fast Blue BB) salt (50 mg / ml) 和 10 µl naphtjol-AS-MX-phosphate (NAMP) (50 mg / ml) (Sigma) 到 1 ml 1×

(32)

detection buffer (0.1 M Tris-HCl，0.1% Tween-20，1 mM levamisole，pH 8.2)。

呈色完成的微卵管在 70% glycerol 中，以微針來分離各個不同時期的胚胎，

將單獨的胚胎放置於載玻片上，並蓋上蓋玻片，當胚胎時期大於 stage 11 時，需要先放置一塊蓋玻片當作架橋的支點，避免胚胎被蓋玻片壓碎，在蓋玻片四周塗上指甲油封片，用 Leica DMR (Leica) 和 Fuji FinePix S2 Pro digital camera (Fujifilm) 來拍照，細胞核染色 (DAPI staining) 是用 Leica TCS SP5 Confocal Spectral Microscope Imaging System 來拍照。

2.4 蛋白質表現

2.4.1 設計引子與接合反應

除了目標基因 Appar-1 本身的專一性引子序列外，必須在前後引子各加上 6 nt 序列為特定限制酶 (前後引子需用不同限制酶) 辨識位置，並在 reverse primer 3' 設計額外的終止密碼子 (stop codon)，以生物資訊軟體 MacVector 去計算從載體 pET-32a (+) (Novagen) 的起始密碼子 (start codon) 到目標基因終止密碼子的 inframe 是否正確可以轉譯出蛋白質，最後設計出 forward primer

Ap_par-1_F1858_NcoI：

5'- CATGCCATGGCTCAAGATTTCAAAGAACCAAAACG -3'，

Ap_par-1_F2356_NcoI:

5'- TATACCATGGCTAGTACTAATTTCAAGCGTCAA -3'；

reverse primer Ap_par-1_R2355_HindIII:

5'- AGCTAAGCTTCTATGGAATGGCCACATTATG -3'，

Ap_par-1_R2877_HindIII:

(33)

5'- AGCTAAGCTTCTAAAACTTGGATGATATTTTTGA -3'

由已定序的 Appar-1_T&A 質體配合上述的引子做 PCR 並回收產物 (步驟參照 2.2.3)，將產物和載體 pET-32a (+) 分別用限制酶 NcoI 和 HindIII 處理 (步驟參照 2.2.6，但兩個限制酶同時使用並需要加入 BSA)，處理 1 小時後以 1% DNA gel 進行電泳來檢查產物和載體的情況，確認有限至酶處理後進行 DNA 沈澱 (參照 2.2.7) 並以光度計 (eppendorf biophotometer) 測液體中 DNA 濃度。取 1 µl pET-32a (+)、1-3 µl PCR 產物 (載體和 DNA 片段的 molecular ration為 1：1~1：2)、5 µl 2×

Rapid ligation buffer (Promega)、1 µl T4 ligase (Promega) 到微量離心管中，充分均勻混合後，放置於 4°C 冰箱過夜，經轉型步驟(參照2.4.2) 後剩餘的溶液可存放至 -20°C 冰箱。

2.4.2 C41 勝任細胞處理和轉型

取出存放在 -80°C 冰箱中的 E. coli mutant strain C41(DE3) 移到液態氮中，以微量吸管尖黏附些許 C41 菌液，塗劃在不含有 ampicillin 的 LB agar 培養皿上，

在 37°C 培養箱中培養約 14~16 小時，以微量吸管尖挑選單一菌落，放入 3 ml LB medium 在 37°C 培養箱中以 250 rpm 培養 14~16 小時，取 100 µl 培養過的 LB medium 加到 20 ml LB medium 中並在 37°C 培養箱中以 250 rpm 培養 2.5 小時，

LB medium 移到 50 ml 離心管中，在 4°C 下以 800 x g 離心 10 分鐘，去除上清液並加入5ml 100 mM CaCl2 (0~4°C)，劇烈搖晃，放在冰上靜置 2 小時，在 4°C 下以 800 x g 離心 10 分鐘，加入 1 ml 100 mM CaCl2 (0~4°C)，在冰上以 64 µl C41 勝任細胞混合液加上 36 µl 60% glycerol 分裝到微量離心管中 (總體積 100 µl)，放入液態氮中急速冷凍，保存至 -80°C 冰箱中。

將 Appar-1_pET-32a (+) 轉型進入 C41 勝任細胞前，應先轉入 JM109 中，萃

(34)

取質體定序並確認序列完全正確，轉型進入 JM109 和萃取質體步驟同 2.2.4 和 2.2.5，以生物資訊軟體 MacVector 確定序列絲毫沒有誤差。從 -80°C 冰箱中取出 C41 勝任細胞並放在冰上解凍，取 2 µl 序列無誤的質體到 100 µl C41 勝任細胞中並混合均勻，在冰上靜置 30 分鐘，移到 42°C 水浴槽加熱 2 分鐘，馬上移到冰上 2 分鐘，加入 400 µl 2× YT buffer (1.6% tryptone，1% yeast extract 和 0.5% NaCl)，

在37°C 水浴槽中 1 小時，取 100 µl 處理過的 C41 勝任細胞和 20 µl 20% IPTG 均勻塗在 LB agar 培養皿 (含 50 µg / ml ampicillin) 上，另取100 µl 處理過的 C41 勝任細胞均勻塗在 LB agar 培養皿 (含 50 µg / ml ampicillin) 上，放入 37°C 培養箱中培養約 14~16 小時，通常轉型成功的細胞，在含有 IPTG 的培養皿上會長得比沒有 IPTG 的培養皿來的小，故可先經由目視來判斷有無成功。

2.4.3 蛋白質小量表現和大量表現

以微量吸管尖挑選由 2.4.2 最後得到的培養皿上的單一菌落，放入含 3 ml LB medium (含 50 µg / ml ampicillin 和 1% glucose) 的 15 ml 離心管，在 37°C 培養箱中以 250 rpm 培養 14~16 小時，取 150 µl 菌液移到另一管含 3 ml LB medium (含 50 µg / ml ampicillin) 的 15 ml 離心管，在 37°C 培養箱中以 250 rpm 培養 1 小時，

以光度計 (eppendorf biophotometer) 測 OD600 是否在 0.5~0.7 的範圍內。加適量的 20% IPTG (0.84 M) 到 3 ml 菌液中 (IPTG 最終濃度 1 mM) 並在 37°C 培養箱中以 250 rpm 培養 5 小時，取 100 µl 菌液到微量離心管中，在 4°C 冰箱以 14000 x g 離心 2 分鐘，去除上清液，加入 50 µl 2× SDS gel-loading buffer (100 mM Tris-Cl，

4% SDS，0.2% bromophenol blue，20% glycerol) (用前加入適當 β-mercaptoethanol，

最終濃度為 200 mM) 並震盪混合均勻，90°C 乾浴槽加熱 10 分鐘，移到冰上靜置 2 分鐘，在 4°C 冰箱以 14000 x g 離心 10 分鐘，收集上清液到另一管微量離心管中，加 10 µl 上清液到 SDS-PAGE gel (做法參照 2.5.3) 的孔洞中，加 5 µl

(35)

prestained protein ladder (green 10 kDa band，Bioman) 到SDS-PAGE gel的孔洞中，

第一階段以 80 Voltage (V) 跑電泳 30 分鐘，第二階段以 120 V 跑電泳 120 分鐘，

將下層膠體取出，浸泡在 Coomassie staining solution (0.1% Coomassie Brilliant Blue R-250，50% methanol，10% glacial acetic acid) 30 分鐘以上，置換至 destain buffer (10% methanol，5% glacial acetic acid) 搖晃清洗至看得清楚各個蛋白質條帶 (band)，置換至清水清洗至隔夜，最後以透明玻璃紙將膠體密封保存。

由小量表現確認蛋白質表現沒有問題後，以微量吸管尖挑選單一菌落，放入含 12.5 ml LB medium (含 50 µg / ml ampicillin 和 1% glucose) 的錐形瓶，在 37°C 培養箱中以 250 rpm 培養 14~16 小時，取 2.5 ml 菌液移到另一管含 50 ml LB medium (含 50 µg / ml ampicillin) 的錐形瓶，在 37°C 培養箱中以 250 rpm 培養 1 小時，以光度計 (eppendorf biophotometer) 測 OD600 是否在 0.5~0.7 的範圍內。加適量的 20% IPTG (0.84 M) 到 50 ml 菌液中 (IPTG 最終濃度 1 mM) 並在 37°C 培養箱中以 250 rpm 培養 5 小時 (過程中每隔 1 小時取 100 µl)，取 50 ml 菌液到 50 ml 離心管中，在 4°C 下 5000 x g 離心 10 分鐘，去除上清液，保存至 -80°C 冰箱中。

將先前每小時取的 100 µl 菌液在 4°C 冰箱以 14000 x g 離心 2 分鐘，去除上清液，

加入 100 µl 2× SDS gel-loading buffer 並震盪混合均勻，90°C 乾浴槽加熱 5 分鐘，

移到冰上靜置 2 分鐘，在 4°C 冰箱以 14000 x g 離心 10 分鐘，收集上清液到另一管微量離心管中，加 10 µl 上清液到 SDS-PAGE gel 的孔洞中，加 5 µl prestained protein ladder (green 10 kDa band，Bioman) 到SDS-PAGE gel的孔洞中，第一階段以 80 Voltage (V) 跑電泳 30 分鐘，第二階段以 120 V 跑電泳 120 分鐘，將下層膠體取出，浸泡在 Coomassie staining solution (0.1% Coomassie Brilliant Blue R-250，

50% methanol，10% glacial acetic acid) 30 分鐘以上，置換至 destain buffer (10%

methanol，5% glacial acetic acid) 搖晃清洗至看得清楚各個蛋白質條帶 (band)，置

(36)

換至清水清洗至隔夜，最後以透明玻璃紙將膠體密封保存。

2.5 蛋白質純化

2.5.1 可溶性測試

先將要用的細胞裂解液 (lysis buffer) 8 M urea buffer (100 mM NaH2PO4，10 mM Tris-Cl，8 M urea) 和 6 M GuHCl buffer (100 mM NaH2PO4，10 mM Tris-Cl，6 M GuHCl) 的 pH 值調整到 8.0，架設超音波細胞破碎機 (sonicator microson XL- 2000，Misonix)，從 -80°C 冰箱中取出 2.4.3 大量表現中含有菌塊的 50 ml 離心管，

靜置於冰上 15 分鐘，加入 5 ml 1× PBS 和 200 µl 25× proteinase inhibitor (Boehringer)，用超音波細胞破碎機以 0.06 瓦特震盪 10 秒，靜置冰上 30 秒，重覆震盪10 秒和靜置冰上 30 秒此步驟 9 次，過程要避免產生氣泡，以免破壞蛋白質結構，取出 20 µl 混合液並標上 CULTURE，另取 20 µl 混合液在 4°C 冰箱以 13000 x g 離心 10 分鐘，分離上清液 (標上 A) 和菌塊 (標上 A’)。剩餘約 5 ml 1×

PBS 的細胞溶解物在 4°C 下以 5000 x g 離心 10 分鐘，將上清液另存至 4°C 冰箱中 (標上 tube A)，加入 5 ml 8 M urea buffer 和 200 µl 25× proteinase inhibitor，用超音波細胞破碎機以 0.06 瓦特震盪 10 秒，靜置冰上 30 秒，重覆震盪10 秒和靜置冰上 30 秒此步驟 9 次，取 20 µl 混合液在 4°C 冰箱以 13000 x g 離心 10 分鐘，分離上清液 (標上 B) 和菌塊 (標上 B’)。剩餘約 5 ml 8 M urea buffer 的細胞溶解物在 4°C 下以 5000 x g 離心 10 分鐘，將上清液另存至 4°C 冰箱中 (標上 tube B)，加入 5 ml 6 M GuHCl buffer 和 200 µl 25× proteinase inhibitor，用超音波細胞破碎機以 0.06 瓦特震盪 10 秒，靜置冰上 30 秒，重覆震盪10 秒和靜置冰上 30 秒此步驟 9 次，取 20 µl 混合液在 4°C 冰箱以 13000 x g 離心 10 分鐘，分離上清液 (標上 C) 和菌塊 (標上 C’)。剩餘約 5 ml 6 M GuHCl buffer 的細胞溶解物在 4°C 下以 5000 x

(37)

g 離心 10 分鐘，將上清液另存至 4°C 冰箱中 (標上 tube C)。在 A~B 中各取 4 µl 上清液並配上 4 µl 2× SDS gel-loading buffer，而 A’~C’ 則加入 40 µl 2× SDS gel- loading buffer 混合均勻後，取 4 µl 混合液，C 因為含有 GuHCl buffer 無法直接跑蛋白質電泳，取 4 µl C 的上清液並加入 196 µl 8 M urea buffer，加入 200 µl 10%

Trichloroacetic acid，靜置冰上 20 分鐘，以13000 x g 離心 15 分鐘，去除上清液，

加 100 µl ethanol (0~4°C) 並混合均勻，以13000 x g 離心 15 分鐘，去除上清液，

開蓋讓殘餘 ethanol 揮發，加入 40 µl 2× SDS gel-loading buffer 混合均勻後，取 4 µl 混合液。將 A~C 和 A’~C’ 的溶液全部加到 SDS-PAGE gel 的孔洞中，加 5 µl prestained protein ladder (green 10 kDa band，Bioman) 到SDS-PAGE gel的孔洞中，

第一階段以 80 Voltage (V) 跑電泳 30 分鐘，第二階段以 120 V 跑電泳 120 分鐘，

將下層膠體取出，浸泡在 Coomassie staining solution (0.1% Coomassie Brilliant Blue R-250，50% methanol，10% glacial acetic acid) 30 分鐘以上，置換至 destain buffer (10% methanol，5% glacial acetic acid) 搖晃清洗至看得清楚各個蛋白質條帶 (band)，置換至清水清洗至隔夜，最後以透明玻璃紙將膠體密封保存。

2.5.2 親和層析法 (affinity chromatography)

從 -80°C 冰箱中取出 2.4.3 大量表現中含有菌塊的 50 ml 離心管，靜置於冰上 15 分鐘，同時準備細胞裂解液 8 M urea buffer (由 2.5.1 得知最適合的細胞裂解液，

需額外加入 10 mM imidazole，若第一次則不需要加)，加入 5 ml 8 M urea buffer (含 10 mM imidazole) 和 200 µl 25× proteinase inhibitor，用超音波細胞破碎機以 0.06 瓦特震盪 10 秒，靜置冰上 30 秒，重覆震盪10 秒和靜置冰上 30 秒此步驟 9 次，取 20 µl 混合液在 4°C 冰箱以 13000 x g 離心 10 分鐘，當之後進行 SDS- PAGE 的樣品，剩餘溶液在 4°C 冰箱以 5000 x g 離心 15 分鐘，取出約 5 ml 的上清液，其中取 100 µl 上清液當之後 SDS-PAGE 的樣品。充分混勻 HisTag binding

(38)

agarose (Bioman) 並取 2 ml 到 10 ml poly-prep chromatography column (Bio-Rad)，

濾掉其中的液體到只剩 1 ml 左右，加 7 ml 8 M urea buffer，濾掉液體到只剩 1 ml 左右，加 7 ml 8 M urea buffer，並以 parafilm 封住 column 的上下開口，以旋轉式振盪器 (rotaing cultivator，TKS RT-01A) 旋轉 10 分鐘，濾掉液體到只剩 1 ml 左右，

重覆加入 8 M urea buffer 並旋轉 10 分鐘此步驟 3 次，加 7 ml 8 M urea buffer (10 mM imidazole)，並以 parafilm 封住 column 的開口，以旋轉式振盪器旋轉 10 分鐘，

濾掉液體到只剩 1 ml 左右，重覆加入 8 M urea buffer (10 mM imidazole) 並旋轉 10 分鐘此步驟 3 次，將先前的處理好的細胞上清液移到 column 中，並以 parafilm 封住 column 的開口，以旋轉式振盪器在 4°C 冰箱旋轉至隔夜。準備含有不同濃度 imidazole 的 8 M urea buffer (2 mM、4 mM、8 mM、10 mM、15 mM、20 mM、50 mM 和 250 mM)，垂直放置好 column (需測水平) 並打開上蓋，靜置 10 分鐘，打開下蓋以濾掉其液體 (保存至 15 ml 離心管，標上 tube 1)，關起下蓋並加入 8 ml 8 M urea buffer，以 parafilm 封住 column 的開口，以旋轉式振盪器旋轉 10 分鐘，

打開下蓋以濾掉液體 (保存至 15 ml 離心管，標上 tube 2)，重覆加入 8 M urea buffer 並旋轉 10 分鐘此步驟 1 次 (保存至 15 ml 離心管，標上 tube 3)，加入 8 ml 8 M urea buffer (2 mM imidazole) (第一次處理故用低濃度 imidazole，若清楚適當的清洗濃度時，則可用較高濃度如 15 mM imidazole 來清洗)，並旋轉 10 分鐘，

打開下蓋以濾掉液體 (保存至 15 ml 離心管，標上 tube 4)，重覆加入 8 M urea buffer (2 mM imidazole) 並旋轉 10 分鐘此步驟 2 次 (保存至 15 ml 離心管，標上 tube 5~6)，加入 8 ml 8 M urea buffer (4 mM imidazole) 並旋轉 10 分鐘，打開下蓋以濾掉液體 (保存至 15 ml 離心管，標上 tube 7)，重覆加入 8 M urea buffer (4 mM imidazole) 並旋轉 10 分鐘此步驟 1 次 (保存至 15 ml 離心管，標上 tube 8)，如此重覆加入不同濃度 imidazole (10 mM、15 mM、20 mM、50 mM) 並清洗 2 次，直

體軸決定基因和眼部發育基因在孤雌胎生豌豆蚜之表現分析

國立臺灣大學生物資源暨農學院昆蟲學系暨研究所 碩士論文

National Taiwan University Master Thesis

體軸決定基因和眼部發育基因在孤雌胎生豌豆蚜之 表現分析

Developmental Analysis of Genes Involved in Axis Determination and Eye Development in the

Parthenogenetic and Viviparous Pea Aphid Acyrthosiphon pisum

姜乃瑋 Nai-Wei Chiang

指導教授：張俊哲 博士 Advisor: Chun-Che Chang, Ph.D.

中華民國 102 年 7 月

July 2013

致謝

目錄

圖目錄

中文摘要

ABSTRACT

第一章 前言

第二章 實驗材料與方法

國立臺灣大學生物資源暨農學院昆蟲學系暨研究所碩士論文

體軸決定基因和眼部發育基因在孤雌胎生豌豆蚜之表現分析

指導教授：張俊哲博士 Advisor: Chun-Che Chang, Ph.D.

第一章前言

第二章實驗材料與方法