抗體免疫染色

2.7.1 酵素受質染色

在 4% paraformaldehyde / PBS (20% paraformaldehyde 以 1× PBS 稀釋) 中解剖 豌豆蚜蟲並紀錄解剖時間，將微卵管移入微量離心管中，以旋轉震盪混合器 (interlli mix RM-2, Elmi) 在室溫下旋轉 40 分鐘 (連同解剖時間在內)，去除溶液，

以 700 µl 0.2% PTx (1× PBS 含 0.2% tritonX-100) 旋轉清洗 10 分鐘，去除溶液，再 重覆加入 0.2% PTx 此步驟 2 次。若需要觀察 stage 11~20 胚胎擇要額外處理 proteinase K，使用 0.1~2 µg / ml proteinase K 處理 10 分鐘，去除溶液，加入 700 µl glycine (2 mg / ml) 旋轉 5 分鐘，去除溶液，再重覆加入 glycine 此步驟 2 次。

以 700 µl 0.2% PTx 旋轉清洗 10 分鐘，去除溶液，再重覆加入 0.2% PTx 此步驟 1 次。加入 500 µl 4% paraformaldehyde / PBS在室溫下旋轉 15 分鐘來重新固定組織，

以 700 µl 0.2% PTx 旋轉清洗 10 分鐘，去除溶液，再重覆加入 0.2% PTx 此步驟 1 次。

以 0.2% PTx 和 methanol 分別配製出 3：1、1：1 和 1：3 比例溶液，加入 500 µl 各比例溶液並旋轉 10 分鐘，去除該溶液並重覆此步驟，加 500 µl 100%

methanol 在室溫下旋轉 1 小時或放 4°C 冰箱震盪至隔夜，以 methanol 和 0.2%

PTx 分別配製出 3：1、1：1 和 1：3 比例溶液，加入 500 µl 各比例溶液並旋轉 10 分鐘，去除該溶液並重覆此步驟，加入 200 µl 1× blocking buffer (DIG wash and blocking buffer set，Roche) 在室溫下旋轉 4 小時，去除溶液，加入 200 µl primary antibody (primary antibody 以 1× blocking buffer 稀釋) 在室溫下旋轉 4 小時或放 4°C 冰箱震盪至隔夜，去除溶液，以 700 µl 0.2% PTx 旋轉清洗 15 分鐘，去除溶 液，再重覆加入 0.2% PTx 此步驟 3 次，加入 200 µl 1× blocking buffer (DIG wash

and blocking buffer set，Roche) 在室溫下旋轉 1 小時，去除溶液，加入 200 µl secondary antibody (secondary antibody 以 1× blocking buffer 稀釋) 在室溫下旋轉 2 小時或放 4°C 冰箱震盪至隔夜，去除溶液，以 700 µl 0.2% PTx 旋轉清洗 10 分鐘，

去除溶液，再重覆加入 0.2% PTx 此步驟 3 次，同時準備 ABC solution (Vectastain Elite ABC kit，Vector Labs)，以 0.2% PTx 稀釋 reagent A (Vector Labs) 濃度成 1%

並混合均勻，加入 reagent B (最終濃度為 1%，Vector Labs) 並混合均勻，加 100 µl ABC solution 在室溫下 旋轉 30 分鐘，去除溶液，以 700 µl 0.2% PTx 旋轉清洗 10 分鐘，去除溶液，再重覆加入 0.2% PTx 此步驟 3 次，將兩顆不同顏色的 diaminobenzidine (DAB，Roche) 放入 1 ml 二次水，將微卵管移到解剖盤上，並加 上 DAB solution 呈色，觀察呈色結果並紀錄呈色時間，以 700 µl 0.2% PTx清洗 15 分鐘來終止呈色反應，去除溶液，再重覆加入 0.2% PTx 此步驟 1 次 (在解剖盤 上)，把微卵管移回微量離心管內，以 700 µl 0.2% PTx清洗 15 分鐘，去除溶液，

再重覆加入 0.2% PTx 此步驟 1 次，將4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI，2 ng / µl) (Sigma) 以 0.2% PTx 稀釋 1000 倍，加 500 µl 1× DAPI (加入 1× DAPI 之後的步 上指甲油封片，用 Leica DMR (Leica) 和 Fuji FinePix S2 Pro digital camera (Fujifilm) 來拍照，細胞核染色 (DAPI staining) 是用 Leica TCS SP5 Confocal Spectral Microscope Imaging System 來拍照。

2.7.2 螢光受質染色

在 4% paraformaldehyde / PBS (20% paraformaldehyde 以 1× PBS 稀釋) 中解剖 豌豆蚜蟲並紀錄解剖時間，將微卵管移入微量離心管中，以旋轉震盪混合器

加入 200 µl 1× blocking buffer (DIG wash and blocking buffer set，Roche) 在室 溫下旋轉 4 小時，去除溶液，加入 200 µl primary antibody (primary antibody 以 1×

blocking buffer 稀釋) 在室溫下旋轉 4 小時或放 4°C 冰箱震盪至隔夜，去除溶液，

以 700 µl 0.2% PTx 旋轉清洗 15 分鐘，去除溶液，再重覆加入 0.2% PTx 此步驟 3 次，加入 200 µl 1× blocking buffer (DIG wash and blocking buffer set，Roche) 在室 溫下旋轉 1 小時，去除溶液，加入 200 µl secondary antibody (secondary antibody

夜，去除溶液，以 700 µl 0.2% PTx清洗 10 分鐘，去除溶液，再重覆加入 0.2%

PTx 此步驟 2 次，加入 300 µl 70% glycerol，放入 4°C 冰箱震盪至隔夜，保存在 4°C 冰箱。

螢光受質處理後的微卵管在 70% glycerol 中，以微針來分離各個不同時期的 胚胎，將胚胎放置於載玻片上，並蓋上蓋玻片，當胚胎時期大於 stage 11 時，需 要先放置一塊蓋玻片當作架橋的支點，避免胚胎被蓋玻片壓碎，在蓋玻片四周塗 上指甲油封片，用 Leica TCS SP5 Confocal Spectral Microscope Imaging System 來 拍螢光受質、細胞核和 F-actin 的訊號。