基因選殖

3.1.1 體軸決定基因 tgfα、EGFR 和 par-1 選殖

找出 NCBI 的模式物種中的體軸決定基因 tgfα、EGFR 和 par-1 蛋白質序列，

分 別 在 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 和 Aphidbase (http://www.aphidbase.com/aphidbase/) 上 進 行 BLASTp ， 找 到 豌 豆 蚜 蟲 的 tgfα (Aptgfα, NCBI reference sequence: XP_003243540.1) 、 EGFR (ApEgfr, NCBI reference sequence: XP_001947927.2) 和 par-1 mRNA (Appar-1, NCBI reference sequence: XP_003247538.1) 序列，並以 Mac vector 設計其專一性引子 (內容同 2.2.2 步驟)，以其引子和 PCR 技術放大其片段，轉殖至其載體 pGEM-T easy 並進 行定序，將序列與其他物種進行比較 (ClustalW alignments) (圖一至三)，確認其定 序片段是該目標同源基因，同時比較各物種基因序列的保守程度。依載體上的片 段方向進行轉錄，分別得到 sense 和 antisense 探針 (圖七至九)，由其探針進行原 位雜合實驗。

預測 Aptgfα 的 coding region 為 863 base pair，可轉譯出 287 amino acids 的蛋 白質，其蛋白質序列上具有一個保守功能區塊 EGF-like domain (Calcium-binding EGF-like domain) (圖一)，與其它模式昆蟲已知 TGFα 以及 D. melanogaster 的 Spitz 和 Keren (相似於 Tgfα) 之功能區塊進行比對後 (Lynch et al., 2010)，其相同 程度達 60~75%；相似程度則達 72~88%。如同 T.castaneum、N. vitripennis 和 G.bimaculatus 一樣，在豌豆蚜蟲基因體序列中，僅能找出單一 tgfα 基因，而並非 像在 D. melanogaster 中可以找到兩個以上相同蛋白質家族的基因，這指出在昆蟲 演化史上，TGFα 蛋白質家族歷經數次演化，而其演化目前只發現在較晚出現的

昆蟲—雙翅目昆蟲。

ApEGFR 的 coding region 為 4278 base pair，可轉譯出 1425 amino acids 蛋白 質 ， 其 蛋 白 質 會 嵌 入 於 細 胞 膜 上 ， 故 蛋 白 質 結 構 上 可 分 成 細 胞 外 區 域 (extracellular region) 以及細胞內區域 (intracellular region)，一為位於細胞內區域的 C-terminal 之 kinase domain (protein tyrosine kinase, PTK)，另一為位於細胞外區域 的 receptor large domain (RL domain) (圖二)，主要為 ligand 結合位置 (Shilo, 2003;

Jorissen et al., 2003)。與各個模式昆蟲 EGFR 全長蛋白質序列比對後，相似程度為 62~70%，而相同程度則為 49~57%，豌豆蚜蟲與其它模式昆蟲的 EGFR 是相當保 守 的 基 因 ， 即 便 昆 蟲 與 哺 乳 動 物 相 較 之 下 ， 彼 此 蛋 白 質 結 構 是 相 當 相 似 的 (Livneh et al., 1985; Shilo, 2003)。

在 D. melanogaster 中可以找到至少五種以上的 par-1 isoform，主要變異的位 置集中在 N-terminal end 和 C-terminal domain 上 (Shulman et al., 2000; Tomancak et al., 2000)，類似的情形也發生在豌豆蚜蟲身上，由 NCBI 預測結果以及本實驗室 選殖結果得知，豌豆蚜蟲至少有五種以上的 par-1 isoform；由 D. melanogaster 的 Par-1 protein 研究可知，具有主要功能以及蛋白質累積於後端的 isoform 為 N1S (Doerflinger et al., 2006)，故由此序列去找尋相似的 1 isoform，得知 Appar-1 isoform 2 是最相似的序列。ApPar-Appar-1 isoform 2 mRNA 為 6734 base pair，可轉譯 出 941 amino acids 蛋白質，其蛋白質結構具有三個保守區塊，分別為 kinase domain、ubiquitin associated domain (UBA domain) 和 kinase associated domain 1 (KA1 domain) (圖三)，其中 kinase domain 到 KA1 domain 之間又稱為 linker region (Shulman et al., 2000; Tomancak et al., 2000)，與線蟲和其他昆蟲已知 Par-1 蛋白質 序列比較之下，全長相似程度為 44~61%，相同程度為 33~58%；其中 kinase domain 和 KA1 domain 相似程度為 92~100%，相同程度 85~97%，UBA domain 相

似程度為 67~86%，而相同程度為 41~76%。因為 Par-1 的 kinase domain 和 KA1 domain 與其他 Par 蛋白家族相當類似，故選殖時將避免使用該處，而改用 linker region 序列去合成探針，此策略與 D. melanogaster 情況相同 (Shulman et al., 2000;

Tomancak et al., 2000)。

3.1.2 眼部特化基因 toy、eya 和 eyg 選殖

選殖方法同 3.1.1 的步驟，差異在於搜尋眼部特化基因 toy、eya 和 eyg 蛋白 質 序 列 資 料 ， 以 此 找 到 豌 豆 蚜 蟲 的 toy (Aptoy, NCBI reference sequence:

XP_001944246.2)、eya (Apeya, NCBI reference sequence: XP_001951198.2) 和 eyg mRNA (Apeyg, NCBI reference sequence: XP_001942532.2) 序列，設計引子和進行 PCR 得到目標片段，加以轉殖至載體 pGEM-T easy 並進行定序，將序列與其他物 種進行比較 (圖四至六)，確認其定序片段是該目標同源基因，同時比較各物種基 因序列的保守程度。依載體上的片段方向進行轉錄，分別得到 sense 和 antisense 探針 (圖十至十二)，由其探針進行原位雜合實驗。

Aptoy coding region 為 1812 base pair，可轉譯出 603 amino acids 蛋白質，其 中蛋白質結構具有 Pax6 家族的保守區塊 pair domain (PD) 和 homeodomain (HD) (圖四)，與其他昆蟲的 Pax6 (Eyeless 和 Twin of eyeless) 比較，pair domain 及 homeodomain 的相似和相同程度為 86~98%，相當符合過去研究指出各個物種 Pax6 的保守功能和結構 (Pichaud and Desplan, 2002)。Pax6 基因在昆蟲演化過程 中發生 gene duplication (Czerny et al., 1994; Rivera et al., 2010)，但目前來看同時具 有兩個 Pax6 基因 (ey 和 toy) 的昆蟲只出現在完全變態昆蟲，不完全變態昆蟲只具 有其中一個 (Czerny et al., 1994)；豌豆蚜蟲基因體解序後，有研究預測蚜蟲基因 體內有 ey 和 toy 基因 (Shigenobu et al., 2010)，但其 ID 為錯誤的代碼，無法在

Aphidbase 網站上找到對應的基因，而 NCBI 及 Aphidbase 搜尋結果都無法找到豌 豆蚜蟲的兩個 Pax6 基因，加上本實驗挑選的片段選殖過程中，也僅能找到一個 Pax6 基因，依據目前結果推測 “不完全變態昆蟲只有一個 Pax6 基因” 假說仍是符 合的。依預測的序列以及選殖的結果與 D. melanogaster 的 ey 和 toy 比較之後，豌 豆蚜蟲的 Pax6 序列較為相似於 Toy (相似度 58%；Ey 的相似度為 37%)；以及豌 豆蚜蟲 Pax6 的 N-terminal pair domain 序列與 Toy N-terminal pair domain 序列相同，

該序列會影響 DNA-binding 效率 (決定 Toy 和 Ey 效率的關鍵) (Czerny et al., 1994)， 知道 EYA domain-1 的功能是與 Sine oculis (So) 或 Dachshund (Dac) 結合，進而調 控下游基因的表現 (Ohto et al., 1999; Ikeda et al., 2002; Li et al., 2003)，推測多出的 該片段可能在與 So 或 Dac 結合上有所影響，甚至多了其他基因調控或是與其他 蛋白質結合的可能性。

Apeyg coding region 為 2073 base pair，可轉譯出 691 amino acids 的蛋白質序 列，其序列上具有兩個保守區塊，分別是 pair domain (PD) 和 homeodomain (HD) (圖六)，其中 PD 可細分成三個小區塊分別為 N-terminal PAI subdomain、linker

region 和 C-terminal RED subdomain；與同樣具有 PD 的 Pax 家族相較之下，昆蟲 Eyg PAI subdomain 的 N-terminus 有序列上的缺失，但在 RED subdomain 的 C-terminus 則多出了約 20 amino acids (Czerny ey al., 1993; Jun et al., 1998; Friedrich and Caravas, 2011)，這情況同樣也發現在豌豆蚜蟲的 Eyg 蛋白質序列上。與其他 昆蟲之 Eyg 蛋白質序列進行比對，保守區塊 PD 的相似程度為 58~86%，而相同 程度為 54~82%；HD 的相似程度為 100%，相同程度 92~95%，其中 PD 的相似度 之所以有如此大的變化，主要來自於 PAI subdomain 的關係，其變異並非只出現 在豌豆蚜蟲，各昆蟲的 Eyg PAI subdomain 保守程度都不高，然而 linker region 和 RED subdomain 則顯得相當保守 (Friedrich and Caravas, 2011)。