蛋白質純化

2.5.1 可溶性測試

先將要用的細胞裂解液 (lysis buffer) 8 M urea buffer (100 mM NaH2PO4，10 mM Tris-Cl，8 M urea) 和 6 M GuHCl buffer (100 mM NaH2PO4，10 mM Tris-Cl，6 M GuHCl) 的 pH 值調整到 8.0，架設超音波細胞破碎機 (sonicator microson XL-2000，Misonix)，從 -80°C 冰箱中取出 2.4.3 大量表現中含有菌塊的 50 ml 離心管，

靜置於冰上 15 分鐘，加入 5 ml 1× PBS 和 200 µl 25× proteinase inhibitor (Boehringer)，用超音波細胞破碎機以 0.06 瓦特震盪 10 秒，靜置冰上 30 秒，重 覆震盪10 秒和靜置冰上 30 秒此步驟 9 次，過程要避免產生氣泡，以免破壞蛋白 質結構，取出 20 µl 混合液並標上 CULTURE，另取 20 µl 混合液在 4°C 冰箱以 13000 x g 離心 10 分鐘，分離上清液 (標上 A) 和菌塊 (標上 A’)。剩餘約 5 ml 1×

PBS 的細胞溶解物在 4°C 下以 5000 x g 離心 10 分鐘，將上清液另存至 4°C 冰箱 中 (標上 tube A)，加入 5 ml 8 M urea buffer 和 200 µl 25× proteinase inhibitor，用超 音波細胞破碎機以 0.06 瓦特震盪 10 秒，靜置冰上 30 秒，重覆震盪10 秒和靜置 冰上 30 秒此步驟 9 次，取 20 µl 混合液在 4°C 冰箱以 13000 x g 離心 10 分鐘，分 離上清液 (標上 B) 和菌塊 (標上 B’)。剩餘約 5 ml 8 M urea buffer 的細胞溶解物在 4°C 下以 5000 x g 離心 10 分鐘，將上清液另存至 4°C 冰箱中 (標上 tube B)，加入 5 ml 6 M GuHCl buffer 和 200 µl 25× proteinase inhibitor，用超音波細胞破碎機以 0.06 瓦特震盪 10 秒，靜置冰上 30 秒，重覆震盪10 秒和靜置冰上 30 秒此步驟 9 次，取 20 µl 混合液在 4°C 冰箱以 13000 x g 離心 10 分鐘，分離上清液 (標上 C) 和菌塊 (標上 C’)。剩餘約 5 ml 6 M GuHCl buffer 的細胞溶解物在 4°C 下以 5000 x

g 離心 10 分鐘，將上清液另存至 4°C 冰箱中 (標上 tube C)。在 A~B 中各取 4 µl 上清液並配上 4 µl 2× SDS loading buffer，而 A’~C’ 則加入 40 µl 2× SDS gel-loading buffer 混合均勻後，取 4 µl 混合液，C 因為含有 GuHCl buffer 無法直接跑 蛋白質電泳，取 4 µl C 的上清液並加入 196 µl 8 M urea buffer，加入 200 µl 10%

Trichloroacetic acid，靜置冰上 20 分鐘，以13000 x g 離心 15 分鐘，去除上清液，

加 100 µl ethanol (0~4°C) 並混合均勻，以13000 x g 離心 15 分鐘，去除上清液，

開蓋讓殘餘 ethanol 揮發，加入 40 µl 2× SDS gel-loading buffer 混合均勻後，取 4 µl 混合液。將 A~C 和 A’~C’ 的溶液全部加到 SDS-PAGE gel 的孔洞中，加 5 µl prestained protein ladder (green 10 kDa band，Bioman) 到SDS-PAGE gel的孔洞中，

第一階段以 80 Voltage (V) 跑電泳 30 分鐘，第二階段以 120 V 跑電泳 120 分鐘，

將下層膠體取出，浸泡在 Coomassie staining solution (0.1% Coomassie Brilliant Blue R-250，50% methanol，10% glacial acetic acid) 30 分鐘以上，置換至 destain buffer (10% methanol，5% glacial acetic acid) 搖晃清洗至看得清楚各個蛋白質條帶 (band)，置換至清水清洗至隔夜，最後以透明玻璃紙將膠體密封保存。

2.5.2 親和層析法 (affinity chromatography)

從 -80°C 冰箱中取出 2.4.3 大量表現中含有菌塊的 50 ml 離心管，靜置於冰上

agarose (Bioman) 並取 2 ml 到 10 ml poly-prep chromatography column (Bio-Rad)，

濾掉其中的液體到只剩 1 ml 左右，加 7 ml 8 M urea buffer，濾掉液體到只剩 1 ml 左右，加 7 ml 8 M urea buffer，並以 parafilm 封住 column 的上下開口，以旋轉式 振盪器 (rotaing cultivator，TKS RT-01A) 旋轉 10 分鐘，濾掉液體到只剩 1 ml 左右，

重覆加入 8 M urea buffer 並旋轉 10 分鐘此步驟 3 次，加 7 ml 8 M urea buffer (10 mM imidazole)，並以 parafilm 封住 column 的開口，以旋轉式振盪器旋轉 10 分鐘，

濾掉液體到只剩 1 ml 左右，重覆加入 8 M urea buffer (10 mM imidazole) 並旋轉 10 分鐘此步驟 3 次，將先前的處理好的細胞上清液移到 column 中，並以 parafilm 封 住 column 的開口，以旋轉式振盪器在 4°C 冰箱旋轉至隔夜。準備含有不同濃度 imidazole 的 8 M urea buffer (2 mM、4 mM、8 mM、10 mM、15 mM、20 mM、50 mM 和 250 mM)，垂直放置好 column (需測水平) 並打開上蓋，靜置 10 分鐘，打 開下蓋以濾掉其液體 (保存至 15 ml 離心管，標上 tube 1)，關起下蓋並加入 8 ml 8 M urea buffer，以 parafilm 封住 column 的開口，以旋轉式振盪器旋轉 10 分鐘，

打開下蓋以濾掉液體 (保存至 15 ml 離心管，標上 tube 2)，重覆加入 8 M urea buffer 並旋轉 10 分鐘此步驟 1 次 (保存至 15 ml 離心管，標上 tube 3)，加入 8 ml 8 M urea buffer (2 mM imidazole) (第一次處理故用低濃度 imidazole，若清楚適當 的清洗濃度時，則可用較高濃度如 15 mM imidazole 來清洗)，並旋轉 10 分鐘，

到 50 mM imidazole 清洗完，加入 8 ml 8 M urea buffer (250 mM imidazole) 並旋轉 10 分鐘，打開下蓋以微量離心管收集所有液體，重覆加入 8 ml 8 M urea buffer (250 mM imidazole) 並收集液體此步驟 1 次，在加入 250 mM imidazole 時，可以 準備 96 孔盤，每個孔加上 45 µl Bio-Rad dye reagent (Bio-Rad)，待收集濾液時，

取 5 µl 濾液至各孔洞中，觀察濾液是否含有蛋白質而使其溶液變色。收集完後，

先準備鑄膠要用的氧化鋁板 (notched alumina plate)、玻璃板、間隔板 (spacer) 和齒梳並組裝之，倒入二次水並計時 20 分鐘，確定過程中沒有任何液體外漏，

有外漏則清洗鑄膠裝置並重新組裝。依實驗需求得知所需的 resolving gel 濃度，

本研究僅使用 10% gel (5 ml，H2O 1.9 ml、30% acylamide mix (Bioman) 1.7 ml、

1.5 M Tris (pH 8.8) 1.3 ml 、 10% SDS 0.05 ml 、 10% ammonium persulfate (AppliChem) 0.05 ml、TEMED (Bioman) 0.002 ml) 和 12% gel (5 ml，H2O 1.6 ml、

30% acylamide mix 2.0 ml、1.5 M Tris (pH 8.8) 1.3 ml、10% SDS 0.05 ml、10%

ammonium persulfate 0.05 ml、TEMED 0.002 ml)，依其濃度的配方配好後，最後 加入 TEMED 後馬上倒入鑄膠裝置中 (約 3 ml)，並且加上約 100~120 µl isobutanol (Panreac) 壓平液面，室溫下靜置約 1~2 小時後，以圖畫紙等紙材吸乾膠面上的 isobutanol，倒入已配好的 5% stacking gel (3 ml，H2O 2.1 ml、30% acylamide mix

0.5 ml、1.0 M Tris (pH 6.8) 0.38 ml、10% SDS 0.03 ml、10% ammonium persulfate 0.03 ml、TEMED 0.003 ml) (倒入前再加 TEMED)，裝上齒梳，室溫下靜置約 1~2 小時，即可包覆保鮮膜保存至 4°C 冰箱中。

待分析的蛋白質樣品須先加入同體積的 2× SDS gel-loading buffer (100 mM Tris-Cl，4% SDS，0.2% bromophenol blue，20% glycerol) (用前加入適當 β-mercaptoethanol，最終濃度為 200 mM) 並震盪混合均勻，90°C 乾浴槽加熱 10 分 鐘，移到冰上靜置 2 分鐘。將膠體同鑄膠裝置架設在蛋白質電泳槽上，倒入 Tris-glycine SDS buffer (Bioman) 後拔除齒梳，並以針筒清洗膠體孔洞，以免有殘渣，

將 5 µl prestained protein ladder (green 10 kDa band，Bioman) 膠的孔洞中，取樣品 (≦15 µl) 加到孔洞中，空的孔洞必須加入 5 µl 1× SDS gel-loading buffer，去除任何 吸附在鑄膠裝置上的氣泡。第一階段以 80 Voltage (V) 跑電泳 30 分鐘，第二階段 以 120 V 跑電泳 120 分鐘，將下層膠體取出，浸泡在 Coomassie staining solution (0.1% Coomassie Brilliant Blue R-250，50% methanol，10% glacial acetic acid) 並搖 晃 30 分鐘以上，置換至 destain buffer (10% methanol，5% glacial acetic acid) 搖晃 清洗至看得清楚各個蛋白質條帶 (band)，置換至清水清洗至隔夜，最後以透明玻 璃紙將膠體密封保存。

2.5.4 抗體製備與純化

估計 2.5.2 步驟的蛋白質濃度後，製作出大片的 SDS-PAGE 膠體，並依照濃 度加約 5 mg 的蛋白樣品至膠體中，並且開始跑電泳，結束後浸泡在 Coomassie staining solution 中，待顏色深至可分辨不同蛋白質條帶時， 置換至 destain buffer 搖晃清洗，過程切誤超過半小時以上，以免膠體吸附過多的 glacial acetic acid，

依照 marker 辨別出預計的蛋白質大小，以美工刀切下其區塊的膠體並以二次水清

洗數次，直到膠體不再有 glacial acetic acid 的氣味，移入 50 ml 離心管內，並通 知生物技術公司來收取樣品作為抗原去生產多株抗體，本次血清來至於兔子。

等血清寄回來後，經 2.6 及 2.7 步驟去測試其專一性和是否有雜訊，再依其 結果決定是否要進行純化。純化時，先取約 0.3 g CNBr 粉末 (GE Healthcare Life Sciences) 與 5 ml 預冷的 HCl (pH 2~3) 攪拌混勻後靜置 15 分鐘，過程中粉末將會 吸收溶液而膨脹，將膨脹的顆粒移至 10 ml poly-prep chromatography column (Bio-Rad) 中，以 8 ml 1 M HCl 去清洗 CNBr 顆粒並濾掉其溶液 (純化過程一律保持液 冰箱並旋轉至隔夜，濾掉溶液後，以 8 ml low pH washing buffer (0.1 M acetic acid，

0.5 M NaCl，pH 4.0) 和 8 ml high pH washing buffer (0.1 M Tris-HCl，pH 8.0) 分別 basic elution buffer (0.1 M triethylamie，pH 11.5)，先加入 10 ml acid elution buffer，

以 10 個微量離心管 (含有 0.1 ml 1 M pH 8.0 Tris，收集時，濃度將變為 100 mM Tris) 各收集 0.9 ml 濾液，先以 10 mM Tris 清洗數次後，將 column 封口封好放在 4°C 冰箱保存，以 2.6 和 2.7 步驟去檢視 acid elution buffer 濾出的液體有無抗體存

在，有且可識別到抗原的話，basic elution buffer 的步驟即可跳過，否則步驟同 acid elution 只是容易不同。可能含有抗體的溶液要先以 1× PBS 置換，並且以低 溫離心的方式濃縮體積，依體積加入 BSA (最終濃度 1%)、NaN3 (最終濃度 0.02%) 和 glycerol (最終濃度 50%) 並保存至 -80°C 冰箱。需要長期保存已使用的 CNBr 顆粒時，先以 0.2 M glycine (pH 2.2) 清洗，直至濾液的 OD 值測不出蛋白質為止，

以 1× PBS 清洗數次，加入 1× PBS/NaN3 (最終濃度 0.02%) 並保存至 4°C 冰箱。

需重覆使用時，加入 5 ml high pH regeneration buffer (0.1 M Tris-HCl，0.5 M NaCl，

pH 8.5) 和 5 ml low pH regeneration buffer (0.1 M NaOAc，0.5 M NaCl，pH 8.0) 分 別清洗，此不同 pH 溶液清洗為一個循環，總共重覆 3 次循環，即可從 “以 8 ml 1mM HCl 清洗 6 次“ 的步驟開始重做。