體軸決定

1.1.1 模式生物的體軸決定機制

觀察昆蟲卵的外觀便可知道，昆蟲在卵的時期便有前後和背腹體軸 (Gutzeit and Sander, 1985)，這說明體軸決定必然早在胚胎發育 (embryogenesis) 前便發生 了，模式生物 Drosophila melanogaster (黑腹果蠅) 的體軸研究中，發現體軸決定 發生在卵細胞發育 (oogenesis) 並藉由兩種方式決定 (1) 卵細胞內體軸決定物質的 聚集 (2) 細胞外間質或體細胞的訊號誘發 (St Johnston and Nüsslein-Volhard, 1992;

Roth, 2003)。D. melanogaster 的微卵管 (ovariole) 中可分出各個不同時期的蛋腔 (egg chamber)，每個蛋腔都是由外層濾泡細胞 (follicle cell) 包覆 15 個營養細胞，

其營養細胞又以細胞質橋 (cytoplasmic bridges 又稱 ring canal) 連結 1 個卵細胞 (oocyte) 以及營養細胞彼此連結 (de Cuevas et al., 1997; Roth, 2003)，體軸決定機制 是發生在卵細胞發育中期 (Roth, 2003)，其主要藉助三種不同基因的 mRNA 在卵 細胞內的聚集，而決定未來胚胎的前後和背腹軸 (Roth and Lynch, 2009)：卵細胞 發育早期時 (stage 5~6)，卵細胞核藉由微管 (microtubule) 移動至後端，接著卵細 胞核周圍的 gurken mRNA 轉譯成 Gurken 蛋白質 (EGF-like protein)，其 Gurken ㄉ 蛋白質將與後端濾泡細胞上的表皮生長因子受體 EGFR (Epidermal growth factor receptor) 結合，傳遞 EGF 訊號進入濾泡細胞，接著由濾泡細胞傳送訊號回卵細胞，

使卵細胞內的微管組織中心 (microtubule organizing center, MTOC) 重新排列而改 變卵細胞內微管極性的分佈 (González-Reyes et al., 1995; Neuman-Silberberg and Schüpbach, 1993)，在卵細胞發育中期 (stage 8~9)，bicoid mRNA 藉由重新排列過 的微管送至卵細胞前端，oskar mRNA 則由微管送至卵細胞後端 (Pokrywka and

Stephenson, 1991, 1995)，bicoid 和 oskar mRNA 的前後聚集建立前後體軸，其聚 集會持續到胚胎發育的早期，而轉譯成蛋白質並且影響前後體軸上各個體節的發 育 (St Johnston and Nüsslein-Volhard, 1992)。同樣在卵細胞發育中期 (stage 7~8)，

因 Gurken 蛋白質 與 EGFR 結合促使微管極性改變，使得位於最末端的中心粒活 (partition-defective) 基因 (par-1, par-3, par-4, par-5 和 par-6) 有能力影響 oskar mRNA 的分布，

進而影響後端體節發育 (Shulman et al., 2000; Tomancak et al., 2000; Cox et al., 2001;

Suzuki and Ohno, 2006)。par 基因研究起源於 Canorhabditis elegans (秀麗隱桿線 蟲)，目前已知在線蟲胚胎發育中，aPKC (atypical protein kinase C)、3 和 Par-6 會在卵受精後聚集在細胞的前端，而 Par-1 和 Par-2 則聚集在細胞後端，使得線 蟲胚胎的前後體軸被決定 (Etemad-Moghadam et al., 1995; Guo and Kemphues, 1995;

Boyd et al., 1996; Tabuse et al., 1998; Hung and Kemphues, 1999) ， 類 似 的 aPKC/Par-3/Par-6 聚集的現象也發生在 Xenopus laevis (非洲爪蟾) 的卵細胞 (Nakaya et al., 2000) 以及 Phallus mamillata (海鞘) 的胚胎中 (Patalano et al., 2006)，

在脊椎動物和節肢動物中發現 par 基因可以決定細胞的極性，進一步影響個體的 前後體軸 (Suzuki and Ohno, 2006; Goldstein and Macara, 2007)。

目前已知的昆蟲模式生物 D. melanogaster 是在昆蟲綱中較晚出現的雙翅目

(Diptera) (Grimaldi and Engel, 2005)，且屬於完全變態昆蟲 (holometabolous insect， RNA interference (RNAi) 技術發現 orthodenticle (Tc-otd) 和 hunchback (Tc-hb) 的表 型 (phenotype) 與 D. melanogaster bicoid 突變型的表現類似，說明 Tc-otd 和 Tc-hb 的功能相當於 bicoid (Frohnhöfer and Nüsslein-Volhard, 1986; Berleth et al., 1988;

Schroder, 2003)；在 N. vitripennis 中也發現類似的實驗結果，otd 和 hb 基因的功 能相當於 bicoid (Pultz et al., 2005; Lynch et al., 2006)；G. bimaculatus 的 otd 基因 表現會決定胚胎頭部的位置 (Nakamura et al., 2010)；Apis mellifera (蜜蜂) (完全變 態昆蟲，long germ band) 的 otd-1、otd-2 和 hb 基因經 RNAi 技術處理後，將會影 響胚胎前端結構的發育 (Wilson and Dearden, 2011)；在後端發育部分，相信是與 wingless/Wnt 訊號有關 (Martin and Kimelman, 2009; McGregor et al., 2009; Petersen and Reddien, 2009)，D. melanogaster 的 wingless 會表現在每個副節 (parasegment) 的後端，但不會影響體軸後端發育，然而在 short germ band 昆蟲 (G. bimaculatus

和 T. castaneum) wingless mRNA 會表現在 growth zone，若以 RNAi 處理 Wnt 訊號 相關的基因 (armadillo/β-catenin 和 wingless)，會出現後端發育不正常的情況 (Miyawaki et al., 2004; Ober and Jockusch, 2006; Bolognesi et al., 2008)，由 RNAi 結 果得知，wingless 能夠調控後端發育基因 caudal 的表現 (Shinmyo et al., 2005;

McGregor et al., 2009)，推論在 short germ band 昆蟲中，Wnt 訊號可以調控 caudal mRNA和體節以及後端發育，而這種模式在 long germ band 昆蟲中並非必要的 (Mito et al., 2010)。

Drosophila melanogaster 的背腹軸取決於 Gurken – EGFR 結合所產生的 EGF 訊號決定的，然而 gurken 基因的出現類似 bicoid 基因，gurken 的直系同源基因 (orthologs) 無法在雙翅目以外的昆蟲發現，目前認為 gurken 是由 tgfα-like 基因高 度特化而成 (Lynch et al., 2010; Lynch and Roth, 2011)，雖無法在其它昆蟲模式生 物 中 發 現 gurken 基 因 ， 但 可 以 在 T. castaneum (Richards et al., 2008) 、 N.

vitripennis (Werren et al., 2010) 和 G. bimaculatus (Lynch et al., 2010) 中找到 tgfα-like 基因，由原位雜合、抗體染色和 RNAi 等技術的應用，得知 EGF 訊號會影響 卵細胞的位置和背腹極性以及濾泡細胞的分佈，除了卵細胞的極性外，在 T.

castaneum 和 N. vitripennis 的胚胎發育中，更可以明顯觀察到胚胎背腹軸的改變 (Lynch et al., 2010; Lynch and Roth, 2011)，經由這些實驗結果推論出一個假設：

在卵細胞發育時期中，卵細胞核的移動是產生 EGF 訊號的重要關鍵之一，當核移 動至背腹側時，該側的濾泡細胞會有 EGF 訊號出現而決定為背側或腹側，卵細胞 受精進入胚胎發育時，該側濾泡細胞提供背腹軸訊號給胚胎，決定胚胎的背腹軸，

此為一種生殖細胞 (卵細胞) 和體細胞 (濾泡細胞) 之間的訊號傳遞 (Lynch et al., 2010)。

1.1.2 以豌豆蚜蟲 tgfα、EGFR 和 par-1 基因來研究其體軸決定機制 象是類似於 bicoid 基因在D. melanogaster 卵細胞前端表現；在卵細胞發育時期無 法偵測到 otd mRNA 表現，說明 hb 基因在A. pisum 無性生殖中仍具有決定前端的 特性，而 otd 基因則不一定 (Huang et al., 2010)；相較於前端有前後體軸決定基因 的聚集，至今仍沒有找到後端的體軸決定基因的聚集 (實驗室過去研究無法偵測

到 wingless 和 caudal mRNA 在卵發育時期的表現)，為了找出 A. pisum 無性生殖 中前後體軸決定的機制，將研究在其它模式生物的卵和胚胎後端累積的基因 par-1 作為碩士班研究的題目之一，希望能藉由原位雜合和抗體免疫染色的方式，觀 察 par-1 mRNA 和蛋白質是否會在卵發育時期累積在後端，進一步證明 Par-1 蛋 白質在後端決定機制裡，是否有相當保守的功能。

另一方面，本研究也涉足到過去無人在 A. pisum 探討的問題，卵發育時期中 背腹軸是何時決定以及如何決定的？由過去文獻指出，在 A. pisum 無性生殖的卵 發育早期，卵細胞核有移動至背腹側的現象 (Riparbelli et al., 2005)，該現象在不 同模式昆蟲中也有發現 (Lynch et al., 2010)，連同 EGF 訊號都被認為是與胚胎背 腹軸有關聯，結合這些線索和觀察，決定以 tgfα、EGFR 和 EGF 訊號下游的分子，

去檢視該背腹軸決定機制是否在各個昆蟲中均為保守？同時希望能藉由其結果，

確認 A. pisum 無性生殖中背腹軸是在哪個時期決定的？