嗜菌體表現技術

Smith GP (1985) 在期刊 Science 上首先提出了噬菌體表現技術(102)，原 理是在絲狀噬菌體 (filamentous bacteriophage) 的三號基因 (filamentous phage gene III， pIII) 上插入外來 DNA 片段而產生出中間具有外來序列的 融合蛋白。此一融合蛋白可以組裝到噬菌體顆粒中，產生具有感染能力又 能夠表現外來胜肽片段的病毒。之後的研究發現，除了在原本的次要外殼 蛋白pIII 可以嵌入且呈現外來胜肽片段外，其主要外殼蛋白 pVIII 與次要外 殼蛋白 pVI 也可以當做嵌入呈現外來胜肽片段的對象。根據對最後挑選出 來的胜肽片段親合力 (affinity) 或者結合力 (avidity) 的需求不同，我們可 以選擇不同外殼蛋白當作呈現外來胜肽片段：主要其中主要外殼蛋白由於 分子數目較多，因此將外來胜肽片段呈現在主要外殼蛋白pVIII 可以篩選出 較高結合力的胜肽片段，相反的，將外來蛋白胜肽片段呈現在次要外殼蛋 白上，則可挑選出較高親和力的胜肽片段。

除了表現外來胜肽片段的噬菌體之外，噬菌體表現技術另外一個主要的 組成是隨機胜肽庫的建立。隨機胜肽庫性質由以下兩點來決定1) 胜肽片段 的長短、2) 構型逼迫式胜肽庫 (conformationally constrained libraries) 或者 構型非逼迫式胜肽庫 (conformationally unconstrained libraries)(103)。

目前所使用的胜肽片段的大小最多可以由 38 個胺基酸所構成，然而一 個胺基酸可以產生20 種變異，一個由 8 個隨機胺基酸所組成的胜肽片段將 具有2.54×10¹⁰種變異，根據統計上的計算，要構成如此龐大的基因多樣性，

必需在細菌的轉型效率上達到1.1×10¹²才有可能達成，而這已經是實驗上可 以達成構築胜肽庫的極限，意味著隨機胜肽庫包含再多的胺基酸並無法再 增加隨機胜肽庫的胜肽多樣性。同時具有更多胺基酸的隨機胜肽片段將需 要產生更穩固的構型來維持與目標的親和力，另外在胜肽片段結構分析以 及非胜肽結構的建立 (development of non-peptide structures) 也將隨著機胜 肽庫所包含胺基酸的增加而更加複雜。

另外是否為構型逼迫式胜肽庫 (conformationally constrained libraries) 也影響挑選出的胜肽片段的性質。比較沒有彈性 (Flexibility) 的胜肽片段可 以降低減少的熵 (entropical costs) 與目標結合，簡單的來說就是沒有彈性 的胜肽片段能與目標有較好的親和力。構型逼迫式胜肽庫是在胜肽兩端分 別加上一個半胱胺酸 (cysteine) 而形成雙硫鍵，使得胜肽可以形成第三級 結構。因此構型逼迫式胜肽庫具有較非構型逼迫式胜肽庫更穩固的構型，

也使得從構型逼迫式胜肽庫挑選出來的胜肽片段與目標有更好的親和力。

本研究的實驗目的就是利用已經發表經由噬菌體表現技術所找到的細 胞專一性胜肽片段呈現在重組腺相關病毒的蛋白外殼的表面，導引攜帶治 療基因的rAAV 到特定細胞，完成基因傳遞的任務。以下是根據已發表的文 獻，所搜尋到的細胞專一性胜肽片段。

1. L14 peptide ：QAGTFALRGDNPQG，擁有 RGD motif 可以感染對 AAV2 感染有抵抗能力的 B16F10 細胞株。在 1999 年 AAV2 的 X-ray 晶 體繞射結構還尚未解出，根據犬小病毒 (canine parvovirus, CPV) 與

AAV 都是屬於小病毒 (parvovirus) 中的一種，且其病毒結構相似，Anne Girod 使用 SOPM algorithm 軟體分析已知 X-ray 晶體繞射結構的 CPV 蛋 白質外殼，並且使用CLUSTAL W program 軟體比對 CPV 和 AAV 的病 毒外殼蛋白序列，找尋出六個可能的位置，位於病毒外殼外緣並且與細 胞做結合，分別是第261、381、447、534、573 及 587 胺基酸的位置，

然後在其後嵌入L14 peptide ，此一胜肽片段是 1999 年 Aumailley 在蛋 白質laminin A chain 中所找到，與細胞結合有關的 motif(104)，分別對 野生型與突變的AAV 組裝病毒基因的能力、L14 peptide 是否可以暴露 在病毒外表、突變的 AAV 是否可以與 B16F10 細胞表面的特殊整合素 受器 (integrin receptor) 結合、與 B16F10 細胞表面的特殊整合素受器結 合是否是因為 L14 peptide 所引導等因子做測試，最後測試突變病毒所 帶的基因是否在能夠B16F10 細胞中表現。根據實驗成果，將 L14 peptide 嵌在第587 號胺基酸後面可以通過以上種種測試，因此證明在第 587 號 胺基酸後面嵌入L14 peptide 可以改變 AAV 感染宿主細胞的趨性，因此 挑選此一胜肽片段當作胜肽導引式基因傳遞系統的控制組之ㄧ(105)。

2. TP A549.1：MTVCNASQRQAHAQATAVSL，此一胜肽片段由 20 個 胺 基 酸 所 構 成 ， 是 屬 於 較 大 的 胜 肽 片 段 ， 原 本 隨 機 胜 肽 庫 構 築 於 bacteriophage coat protein pIII，系統是參考自 S.E. Cwirla (1990) 在 PNAS 上發表的系統。TP A549.1 可以專一性的將噬菌體引導至人類肺 癌細胞A549(106)。

3. C2C12 12.51：TARGEHKEEELI，此一胜肽片段由 12 個胺基酸所構 成，可以專一性的引導噬菌體與 C2C12 細胞株結合並使腺病毒感染 C2C12 細胞株。Debadyuti Ghosh 在其研究中認為：生產細胞專一性的 基因載體，可以藉由在病毒蛋白外殼表面放置細胞專一性的胜肽，引導 基因載體到感興趣的細胞種類中。但是把特殊的胜肽片段直接置入病毒 蛋白外殼可能會造成病毒外殼失去功能、造成胜肽片段因構形改變而失 去功能、無法組裝完整的病毒、或者破壞整個病毒結構，使得整個細胞 專 一 性 基 因 載 體 失 去 功 能 。 因 此 作 者 設 計 了 以 下 的 實 驗 ：1) 將 Adenovirus 裝載外來胜肽片段的骨架放到絲狀噬菌體上，2) 再將隨機 胜肽庫放置在絲狀噬菌體上的 Adenovirus 骨架上。3) 經由噬菌體對 C2C12 細胞株呈現 Adenovirus 骨架上的隨機胜肽片段，找到 C2C12 專 一性的胜肽片段，4) 最後再將此一片段放到 Adenovirus 原本的骨架 上，產生可以專一性感染 C2C12 的 Adenovirus。根據此篇文獻，挑選 C2C12 12.51 這個胜肽序列，當做測試可以放置並引導 Adenovirus 感染 C2C12 細胞株的胜肽片段，是否可以引導 AAV 感染 C2C12 細胞株(107)。

4. GE11：YHWYGYTPQNVI，此一胜肽片段由 12 個胺基酸所構成，可 以專一性的Epidermal growth factor receptor (ErbB1, EGFR)結合。多種人 類多細胞都能表現EGFR，其的在細胞生長、分化與遷移上扮演重要的 角色。研究發現由EGFR 向細胞內傳遞的訊息將會造成增加細胞增生，

減少細胞程序凋亡，並且使腫瘤提升細胞移動能力與血管新生成。

Zonghai Li 等人使用 NEB 公司的產品 Ph.D.-12™ Phage Display Peptide Library Kit，篩選出可以跟 EGFR 蛋白結合的胜肽序列，GE11(108)。

5. RG2 P2L：DYDMTKNT，此一胜肽片段由 8 個胺基酸所構成，可以 專一性引導噬菌體與 RG2 細胞株結合。研究中使用三種方法來挑選對 惡性神經膠細胞 (malignant glial cells) 有結合能力的胜肽片段，(圖十 五)。第一種是直接使用 RG2 細胞做篩選，挑選出對 RG2 有高親和力的 胜肽片段，以及可以被 RG2 吞噬的胜肽片段，這樣的胜肽片段沒有經 過事先的挑選，因此可能具有或者不具有與其他種類細胞結合的特性。

在第二種篩選方法是使用對纖維組織母細胞 (fibroblasts)、肌肉組織母 細胞 (myoblasts)及肝細胞 (hepatocytes) 進行負篩選，挑選無法跟以上 細胞結合的胜肽片段，再挑選對 RG2 有高親和力的胜肽片段，以及可 以被 RG2 吞噬的胜肽片段，經由這些步驟之後，可以得到對腦有專一 性的胜肽片段。第三種方法是透過減少每種噬菌體片段的個數，並加入 阻礙噬菌體 (blocking phage)減少非專一性的結合，再使用第二種方法挑 選無法對星細胞 (astrocytes)、肌肉組織母細胞及肝細胞有親和力的胜肽 片段，最後從這些胜肽片段挑選出對 RG2 細胞有專一性的胜肽片段。

根據實驗結果，第二種方法找到的 RG2 P2L，我挑選利用第二種方法找 出的胜肽片段置入胜肽引導式細胞專一性基因傳遞系統(109)。