病毒性基因治療載體

在活體的基因治療中，可以選擇病毒性的載體如腺病毒載體 (adenoviral vector)、牛痘病毒載體 (vaccinia viral vector) 來達到短暫基因表現的目的，

也 可 以 使 用 反 轉 錄 病 毒 載 體 (retroviral vector) 、 腺 相 關 病 毒 載 體 (adeno-associated viral vector)來達到長期基因表現的目的。以下就是對各個 病毒性基因治療載體的分別介紹：

1. 傳統反轉錄病毒載體 (retroviral vector)

目前基因治療所使用的反轉錄病毒主要是來自老鼠的反轉錄病毒

（MLV），它也是最早用來進行人體試驗的病毒載體。這是個 RNA 帶 有被膜（envelope）的病毒。其生活史中，會經由反轉錄作用而形成雙 股 DNA，再嵌入宿主染色體上，達到基因轉殖及持續表現之特色。要 建構此載體，通常是將病毒基因上所有病毒基因序列加以剔除而以治療 用基因取代之。但一些重要序列，如包裹用訊息 (packaging signal, φ)，

嵌入染色體所需之序列(long terminal repeat, LTR)，及複製相關之序列

(polypurine tract, PPT)，則保留在載體上。部份研究者甚至會將一些增 加基因表現或增加病毒力價有關序列，例如WPRE 或 gag 5'端的部份序 列，亦放在載體上，以增加載體之表現效率。載體上之5'端及 3'端 LTR 可進一步加以改良，以增加其表現能力及安全性。將 5'端 LTR 上之 U3 啟動子改為 CMV 之加強子/啟動子，則此 CMV/LTR 嵌合啟動子 (hybrid promoter) 可有更高的表現能力。而在 3' 端 LTR 上的 U3 處將 啟動子序列加以破壞，則造成所謂SIN 載體 (self-inactivating vector)。

其主要原理是利用反轉錄病毒載體之反轉錄步驟，則 3' LTR 上之 U3 屆時將成為5' LTR 上之啟動子。如此破壞的結果，造成其自我去活化 (self-inactivation)。這個用意主要是在減少在標的細胞內表現時，反轉錄 病毒載體之內在啟動子與 LTR 之間形成互相干擾表現的現象。但此類 載體的設計，亦會大大降低其載體病毒力價。至於形成重組病毒所需之 其他病毒蛋白基因，如gag、pol 及 env，通常是由另一個質體 (即所謂 包裝質體) 來提供。為了要避免此質體與表現載體之間產生任何重組而 形成野生型病毒，這個包裝質體上之包裹訊息 (φ)、PPT、3'端 LTR 都 會全部予以剔除，且 5'端 LTR 也會換成 CMV 之類的啟動子。更進一 步的改良，則是將 gag、pol、env 等基因分裝在不同質體內，再以穩定 表現方式送入特定細胞內，建立所謂的包裝細胞株（packaging cell line），如此就更減少因重組而產生野生型病毒的問題。目前使用之 env 多半是選自雙嗜性 (Amphotropic) 反轉錄病毒 (既能在宿主細胞，又能

在異種細胞上引起產毒性感染)，故所製造出來之重組反轉錄病毒具有 可感染多種不同細胞的特性。雖已有如此多重的改善，然而反轉錄病毒 只能感染分裂中的細胞，且其病毒力價偏低 (10⁵-10⁶ cfu/ml)，在體內又 非常脆弱，易被補體所摧毀，造成反轉錄病毒載體使用上仍有很大瓶 頸。針對這個問題，目前已有一些改良式的反轉錄病毒載體出現，即利 用水泡性口炎病毒 (vesicular stomatitis virus, VSV) 之 G 蛋白來取代反 轉錄病毒之被膜蛋白，用以包裹病毒顆粒，形成所謂的假形反轉錄病毒 (pseudotyped retrovirus)。這類假形病毒顆粒具有相當高的穩定性，並經 得起離心，濃縮，故可使病毒力價提升至10⁸-10⁹ cfu/ml，大大地提高了 感染的效率。

2. 人類反轉錄病毒載體 (lentiviral vector 或 HIV vector)

人類反轉錄病毒與傳統反轉錄病毒最大不一樣在於它可以感染不 分裂的細胞，且其基因體上大多具備了許多輔助因子基因，對其生活史 上可能具有某些功能。相似於傳統之反轉錄病毒載體的設計，HIV 載 體亦須帶有重要之序列以利載體之複製及包裹。例如Ψ訊息序列；PPT 序列可增進病毒DNA 送入核內的功能；而載體的 3'端若有 WPRE 序列 則可大大增加基因的表現。至於組裝病毒所需之結構蛋白，則是由另一 個質體來提供。第一代的 HIV 載體系統所用之包裝質體只剔除了 env 的序列，而由另一個質體DNA 提供 VSV-G 之 Env 蛋白，約百分之八

十的病毒序列仍保留在包裝質體上，故危險性較高。第二代的 HIV 載 體系統，則將一些輔助因子基因 (如 vpr、vpu、vif 及 nef) 從包裝質體 上再剔除，只剩下由HIV 之 LTR 啟動子所表現之 gag、pol、tat 及 rev。

第三代載體甚且將包裝質體改為 CMV 啟動子，故也不再需要 tat，而 將其由此質體上剔除，甚且將rev 分設在另外質體上。最後呈現之 HIV 載體是最具安全性的組合。利用 293T 高效率轉染技術及 VSV-G 可經 得起濃縮的特性，一般都可拿到1 x 10⁸ -1 x 10⁹ IU/ml 的病毒顆粒。不 過每次都得做共同轉染實驗，是生產 HIV 載體比較麻煩的地方，原因 是HIV 載體系統比較難製備成包裝細胞株，因為 VSV-G，Gag 及 Tat 等 蛋白對細胞之毒性較高，除非做成可調控性 (inducible) 的表現，否則 很難建立起穩定表現的細胞株。

3. 腺病毒 (Adenovirus)

腺病毒是一個中等大小之DNA 病毒 (35 kb)。感染人體之後，體內 多半會引發免疫反應 (T 及 B 細胞) 來清除病毒的感染。目前血清學檢 查發現約有40% ~ 60%的小孩已有對抗血清型 1 型、2 型及 5 型病毒 的抗體存在。而 Ad5 又是目前最常用於基因治療載體設計的一種，，

故也是腺病毒載體在臨床上應用碰到最大的困難。強烈的免疫反應，除 了使轉殖基因只是短暫表現外，可能也會對病人產生極大的副作用，甚 且休克。腺病毒的複製史中，有基因表現有分為早期 (E1A，E1B，E2，

E3，及 E4)、中期 (IX 及 IVa 2)、及晚期 (結構蛋白，ML) 三個階段；

其中 E1A 對其他早期病毒基因的表現是絕對必須的。第一代腺病毒載 體是將 E1 及 E3 剔除。E1 剔除是使重組腺病毒將來在標的細胞內不 具有複製能力；E3 剔除是為了增加容納轉殖基因的空間。使用載體的 方法，乃是利用同源基因重組 (homologous recombination)，將基因表現 之卡帶 (cassette) 質體與不含 E1 部份之病毒基因體同時轉染進 293 細 胞，經過重組後，再由293 細胞所提供的 E1 基因來複製重組病毒。重 組病毒可用來感染標的細胞或個體組織。腺病毒的病毒力價一般非常高 (10¹⁰ cfu/ml)，病毒顆粒穩定，所以常可用來直接進行活體內轉殖。腺病 毒可以感染分裂或者不分裂的細胞，這些都是它優於反轉錄病毒之處。

但相對的，腺病毒不嵌入細胞染色體中，又不會在細胞內複製，故在一 段時間後，經細胞分裂，病毒DNA 可能就消失掉，表現亦告中止。同 時，如前述腺病毒載體在體內造成非常嚴重的免疫反應，這也是造成帶 有腺病毒載體的標的細胞在體內很快就會被消滅的原因之一。第二代腺 病毒，為了更降低這些低量的病毒複製的機率及免疫反應的發生，進一 步再將E2a 基因 (DNA-binding protein) 及 E4 由載體上去除，而改由 製備細胞株來提供。第三代病毒載體甚至將更長的病毒基因體完全去除 而用幫住病毒 (helper virus) 來幫忙，以企圖完全斷絕病毒載體在標的 細胞內的複製能力，如此一來即可降低宿主的免疫反應，以及增長載體 基因的表現時間。