第四章 材料與方法
4.3 酵素催化反應
4.3.2 PCR
PCR 分為兩個部份，一個是引子設計的部份，一個是 PCR 設計的部份。
在引子設計的部份要注意下列幾點：
1. 引子序列中注意是否需要 ATG 序列或者 Stop codon。
2. 引子中要包含大約 50％的 GC，如果 AT 大於 50％的話，需較低的溫 度才能使引子與模版結合。而引子與模版結合的溫度我們稱之為 Tm 值，這個值並不是不變的，根據不同的化學環境如鹽度不同以及引子序 列排列方式及各種核甘酸的組成不同而有變化，理想Tm 值設計在接近 55℃。Tm 可以藉由一些軟體如 Invitrogen 的 Vector NTI 裡面的功能來 推估，也可以使用以下公式粗估：
Tm = 4 × (G+C) + 2 × (A+T)
3. 以下是使用不同 DNA 聚合酶 PCR 時，配合引子長度序列，大約推 估的PCR 時引子與模版黏合的溫度：
For Taq Tm － 7= 引子與模版黏合的溫度 For Vent Tm － 5= 引子與模版黏合的溫度
4. 引子長度設計應該在 20~25 bp 左右是比較恰當的 (不包含外加的序 列如限制酶切割位)
5. 引子內序列注意不要有迴文。
6. 引子的 3’端不要 G or C 以避免在 PCR 的時候引子之間提早開始黏 附，造成非專一性的PCR 產物。
7. 進行點突變引子設計時，突變的點應該要設計在 5’端而不要設計在 引子的3’端，以避免 PCR 失敗。
8. 在引子 5’端所設計的限制酶切割位必須在最外端添加 4bp 的隨機核 甘酸，以避免限制酶的內切酶特性而使得限制酶切割反應失敗或者不完 全。
在PCR 設計的部份，有幾個比較應該注意的部份，以下分點說明：
1. PCR 是由 denature-annealing-extension 三個步驟重複而產生。使用 Mastercycler Autorisierter thermocycler 提供溫度的變化：95℃使得模板 DNA 雙股分離 (denature)，然後降溫到適當的溫度 (通常是 55℃)，使 引子能夠與模版DNA 結合 (annealing)，接著將溫度提升到熱穩定 DNA 聚 合 酶 反 應 適 合 的 溫 度 ( 通 常 是 72℃) 進 行 DNA 聚 合 反 應 (extension)，然後又回到 95℃ denature 進到下一個循環。
2. PCR 中引子能夠與模版 DNA 結合 (annealing)的溫度是影響整個反應 好壞的關鍵步驟。當整個 PCR 反應沒有產生任何產物時，除了確認各 個反應物有沒有加錯以及酵素有沒有壞掉以外，失敗原因可能是因為調 整的 annealing 太高而造成引子沒有與模版結合，使得整個實驗沒有產 物出現，因此降低實驗 annealing 的溫度，也許就可以解決此一問題。
另外，annealing 溫度太低可能會造成引子與模版之間不專一性的黏合或
者引子之間不專一性的結合，而產生非專一性的 PCR 產物，此時可以 藉由提高annealing 溫度來減少非專一性的黏合。
3. 在使用熱穩定 DNA 聚合酶進行反應時應該注意其適合的反應溫度，
使用不適當的反應溫度可能會使得反應速度變差、失敗、出現非專一性 的PCR 產物或者更容易產生突變。
4. 不同的熱穩定 DNA 聚合酶的反應速度不同，以 Taq DNA 聚合酶而 言，其DNA 聚合反應一分鐘可以合成約 1kb DNA，相對的 DNA 聚合 酶pfu 每分鐘只能合成 600bp 左右，因此在 extension 時間要根據反應產 物的大小與所使用的熱穩定DNA 聚合酶決定。
5. 根據不同的使用用途去使用熱穩定 DNA 聚合酶，例如一般實驗室使 用PCR 的熱穩定 DNA 聚合酶是 Taq，因為其價格較便宜，也足夠應用 於一般實驗，但是如果需要比較高傳真低錯誤率的PCR，TaqDNA 聚合 酶平均每 500 bp 會出現一個突變可能就不能達到這樣的要求，此時具 有校正的熱穩定DNA 聚合酶 pfu 就可以取代 Taq，使用於對於低錯誤率 需求較高的實驗。但是一般而言，pfu 的價格較 Taq 更高，因此在質體 構築使用上，是運用pfu 來減少 PCR 反應實驗突變的機率，而在一般檢 測基因是否已經插入載體的PCR 則是使用 Taq 來完成。
6. 另外，適當的反應緩衝液也是使得 PCR 能夠成功的關鍵因素之ㄧ，
因為不同的離子強度、鹽度、pH 值會影響模板與引子的結合、酵素與 DNA 的結合，使用商品化實驗套組所附的 RCR 反應緩衝液，可以避免
因為RCR 反應緩衝液配製的誤差而得到不好的 RCR 反應。
實驗所使用之
PCR
是運用Pro Taq DNA Polymerase 實驗模組(波仕特, 台灣, 中華民國)與 pfu DNA Polymerase 實驗模組 (生工, 台灣, 中華民國) 來進行DNA 片段的增幅，實驗流程如下：取一0.2mL 微量離心管，加入適當體積滅菌的二次水，5.0μL 之 10×
PCR
反應緩衝液，dNTP 1.0μL (10mM)，5~10ng 之模版 DNA，兩股引子，用滅 菌的二次水將體積補足至49.5μL，最後加入 0.5μL 之 DNA 聚合酶
(5U/μL)，反應總體積為 50μl。使用振盪混合，短暫離心後置於 Mastercycler Autorisierter thermocycler 進行