胜肽導引式基因治療載體質體的建構

我們的目的是建構出胜肽導引式基因治療載體質體，由此一質體所生產 出來的重組腺相關病毒將失去廣泛感染細胞的能力，並且能藉由載入的細 胞專一性胜肽基因序列，而使得重組腺相關病毒得到專一性感染細胞的能 力。

為了破壞 rAAV 經由細胞表面受器 HSPG 感染細胞的能力，我們使用 Site-directed mutagenesis of overlap extension 將其位於 Heparin binding site 的 第 585、588 號精胺酸突變為丙胺酸。根據我們所使用的 AAV Helper-Free System，Heparin binding site 位於質體 pAAV-RC 上的病毒蛋白外殼基因 (cap gene)中，因此我們選擇 pAAV-RC 當做突變的 cap gene 選殖的載體。

4.4.1 突變 Capsid 基因之取得

在我的Site-directed mutagenesis of overlap extension 實驗中，我在病毒 蛋白外殼基因上設計兩次突變，第一次的突變 MVP3 在不更動其它任何胺 基酸序列的情況下，將其位於Heparin binding site 的第 585、588 號精胺酸 突變為丙胺酸：R585A、R588A，命名為 pAAV-mRC。使用的引子是 FM：

MVP3F、F2：pVP3F (BsiWI)、RM：MVP3R、R2：pVP3R (XcmI)基因序 列如表，實驗步驟，(圖十七)。

第二次的突變M2VP3 維持了第一次突變的 R585A、R588A，但是在此 二個胺基酸基因中間添加了兩個限制酶切割位 NheI/NotI，然後調整限制酶 切割位與刪除第585 與 588 號胺基酸中間的基因，方便未來載入胜肽片段，

此一突變命名為 pAAV-m2RC，使用的引子是 FM：M2VP3F、F2：pVP3F (BsiWI)、RM：M2VP3R、R2：pVP3R (XcmI)基因序列如表，實驗步驟，(圖 十七)。

這兩個突變的病毒蛋白外殼基因使用pVP3F (BsiWI)與 pVP3R (XcmI) 來增幅，得到由BsiWI 與 XcmI 兩個限制酶切割位所包圍的 PCR 產物。接 著使用Gene-SpinTM 1-4-3 DNA Extraction Kit 進行 PCR 產物的純化，測量 OD260 計算 DNA 的濃度，並使用洋菜膠電泳分析是否得到正確的 PCR 產 物。

4.4.2 突變基因的選殖

突變基因選殖的載體pAAV-RC 來自商品化的實驗模組 AAV Helper-Free System，取 1ng pAAV-RC 質體 DNA 進行勝任細胞大腸桿菌 ECOS 101 的轉 型，然後使用玻璃小珠將菌液均勻塗布在含抗生素的LB 培養基上，37℃培 養12 小時挑菌。挑出單一菌落到 100mL 含抗生素的 LB 培養液中，於震盪 保溫器37℃ 225rpm 培養 16 小時。收集培養後的菌液於高速離心管中，離 心 8000rpm 15 分鐘，小心的將上清液到乾淨，使用 High-copy Plasmid Purification 實驗套組進行大量質體 DNA 的純化，並將質體 DNA 溶於水中，

並測量 OD260 計算其濃度。其後以限制酶 XcmI 對其進行限制酶切割反應 兩小時，然後立即以洋菜膠電泳分析其片段，觀察片段大小是否吻合。

確定純化的質體是pAAV-RC 後，進行限制酶 XcmI 切割反應。取 10μg 的pAAV-RC 放入 0.2mL 微量離心管，加入適當體積滅菌的二次水，10.0μL 之 10X 限制酶切割反應緩衝液 Buffer 3，用滅菌的二次水將體積補足至 90~95μL，最後加入 5μL 之限制脢 XcmI (NEB)，反應總體積為 100μl。使用 振盪混合，短暫離心後置於適當37℃之水浴加熱器中作用 16 小時，而後迅 速置於冰上，接著使用Gene-SpinTM 1-4-3 DNA Extraction Kit 純化之。取 5μL 純化後的產物進行洋菜膠電泳分析，確定片段正確，將剩餘的產物進 行限制酶 BsiWI 切割反應。取純化完後的產物，放入 0.2mL 微量離心管，

加入適當體積滅菌的二次水，10.0μL 之 10X 限制酶切割反應緩衝液 Buffer 2，用滅菌的二次水將體積補足至 90~95μL，最後加入 5μL 之限制脢 BsiWI

(NEB)，反應總體積為 100μl。使用振盪混合，短暫離心後置於適當 55℃之 水浴加熱器中作用 16 小時，而後迅速置於冰上，使用 Gene-SpinTM 1-4-3 DNA Extraction Kit 純化之，對於這一個步驟的產物，我們希望得到濃度比 較高的 DNA，因此在純化的最後一步，我們只加入 30μL 的無菌二次水洗 提DNA。測量產物的 OD 值，並使用洋菜膠電泳檢測其限制酶切割後 DNA 片斷大小是否與其基因圖譜相符。確定後進行下一步的反應。

取純化後的載體骨架分別以1：3、1：6、1：9 的分子數與突變 DNA 片 段進行接合酶接合反應。取 700ng 的載體骨架及 240ng、480ng、720ng 的 突變DNA 片段各別置入 0.2 mL 微量離心管中，依序加入適當量的無菌二 次水、1.5μL 接合酶接合反應緩衝溶液、1.5μL 的 25mM ATP、加入無菌二 次水將總體積補足為 13.5μL，最後加入 1.5μL 的接合酶。使用振盪混合，

短暫離心後置於室溫中作用24 小時。

取接合載體骨架分別以1：3、1：6、1：9 的分子數與突變 DNA 片段進 行接合酶接合反應的反應產物5μL 進行勝任細胞的質體轉型，塗盤並 37℃

培養12 小時。於三個組別中各挑選兩個菌株進行篩選，挑選出含有突變基 因的菌株。