重組腺相關病毒在基因治療上的限制與改進

雖然重組腺相關病毒在作為基因治療上有很多的優點，但是仍然有許多 值得改進的地方。在作為基因治療的載體上，重組腺相關病毒可以廣泛感 染人類的細胞是一個優點也是一個缺點，優點是感染的細胞種類眾多，在 細胞實驗上使用限制就比較小；但是缺點是實驗最後的目的都是希望應用 在人體上，廣泛感染人類細胞會造成治療用的基因在錯誤的組織或者器官 表現，導致病人產生不可預期的疾病。因此改善腺相關病毒的專一性是許 多科學家研究的課題：

1. Jeffrey S. Bartlett (1999) 使用 bispecific F(ab´g)2 antibody 的技術，此 一技術包含兩種抗體，分別可以結合AAV 與 megakaryocyte 細胞，連結 這兩種抗體，拉近AAV 與 megakaryocyte 細胞，使得 AAV 更專一性的 感染megakaryocyte 細胞(93)。

2. Shaun R. Opie (2003) 利用點突變的方法測試結構性蛋白上的哪些胺 基酸影響Heparan binding site 與 HSPG 交互作用，結果當第 585 號與第

588 號的精胺酸 (arginine) 被突變成丙胺酸 (alanine) 時，AAV 失去了 大部分的感染能力，根據實驗結果，第 585 號與第 588 號的精胺酸 (arginine) 在 heparan binding site 與 HSPG 的結合上扮演重要角色(94)。

3. Muller OJ (2003) 在病毒的結構性蛋白上的 heparan binding site 做突 變，並插入一段隨機的 peptide 片段，使得 AAV2 改變其感染趨性，成 功的讓 AAV2 可以感染人類冠狀動脈內皮細胞並失去感染其他細胞的 能力(95)。

4. Warrington KH Jr (2004) 則提出結構性蛋白 VP2 的 N 端序列是非必需 的，可以將之去除並加入一段最大30kDa 的蛋白質序列，提供三級結構 與細胞表面的受體結合(39)。

可攜帶基因片段太小也是AAV2 應用在實驗上的缺點之一，因為野生型 的AAV2 其基因組大小約是 4650 nucleotides，因此在去除 rep 基因和 cap 基 因之後，中間可以放入一個啟動子與 2~3kb 的基因，然而一般人類的基因 通常大於2~3kb，導致以 AAV 為基礎的病毒載體無法攜帶過大的基因組，

無法形成具感染力的病毒顆粒。故為了改善此缺失，許多研究提供不同方 法，以增進可攜帶基因的長度。

1. Yan Z (2000) 在期刊 Nature medicine 中提出：可以將大型基因分成 兩個部分並放到兩個rAAV 質體中，再利用剪接訊號 (splice signal) 使 得大型基因片段轉錄出的 mRNA 結合在一起，表現出完整有功能的蛋 白質(96)， (圖十四)。

2. Adenovirus 擁有攜帶大片段基因以及有效率且不受限於細胞週期 (cell-cycle) 將基因傳遞到細胞核的能力，而 AAV 可以具有長期基因表 現及具有不攜帶病毒基因的特質，Manuel A. F. V. Gonçalves 結合 Adenovirus 與 AAV 的優點，建立了 AAV/Ad 雜合病毒載體。這個病毒 載體結合了AAV 的複製機制與 Adenovirus 病毒包裹的過程，利用腺病 毒的包裹序列與腺相關病毒的基因組結合，並克服腺病毒污染的情 況，產生了高容量的雜合病毒(97)。

3. Harper SQ 則使用另外的策略，先將 dystrophin 的功能作詳細的分析，

並且分割成許多小小的功能片段，把這些具有部分功能的基因利用 AAV 載體送到宿主細胞中，一起執行完整的功能(84)。

4. Grieger JC (2005) 在其論文中指出缺乏結構性蛋白的 VP2 並不會影 響AAV 感染細胞時的效率，相反的，在沒有 VP2 存在的情況下，可以 提升AAV 對於 DNA 的容量，最多可以達到 6.0kb(98)。

以 AAV 當做治療用基因載體，在活體實驗上遇到的另一個問題是無法 立即表現治療用基因，通常在注射後有四到六個禮拜的延遲時間，才會開 始表現治療用基因，AAV 第二股的合成是造成延遲的主要的原因。McCarty DM (2001) 設計了一個自我互補的 rAAV 的基因治療載體，這個基因載體 包含雙股 DNA 的基因組，不僅可以避免因為合成 AAV 的第二股所造成的

延遲，另外在細胞實驗中亦提高了感染細胞的效率達140 倍(99)。