細胞培養

研究中使用建立好的細胞庫系統，提供品質一致的細胞進行研究。自冷 凍管中取得原始的細胞株進行細胞解凍、培養。經過四次細胞繼代培養之 後，計算適當量的細胞數，並將細胞依一定的數量 (2×10⁶個細胞/一隻冷凍 管) 進行細胞冷凍。冷凍的細胞放置-80℃冰箱隔夜，然後移至液態氮中保 存，此次冷凍的細胞稱為第一代細胞株。取第一代細胞株進行細胞解凍、

培養。經過四次細胞繼代培養之後，計算適當量的細胞數，並將細胞依一 定的數量 (2×10⁶個細胞/一隻冷凍管) 進行細胞冷凍。冷凍的細胞放置-80

℃冰箱隔夜，然後移至液態氮中保存，此次冷凍的細胞稱為第二代細胞株。

重複以上步驟，取得第三代細胞株。

於之後的細胞實驗中，皆取繼代培養四次以後的第三代細胞株進行實 驗。當使用盡第三代細胞株時，取第二代細胞株，使用同樣的步驟，增殖 出第三代細胞株。

4.6.1 細胞培養液

實驗中所使用的細胞培養液是使用以DMEM (Gibco, NY, USA) 為基 礎，包含10% FBS (Biological Industries) 及 1% PSA 抗生素的細胞培養液。

冷凍培養液是以DMEM 細胞培養液為基礎，包含 7%的 DMSO 的冷凍培養

液。

4.6.2 細胞株

實驗中所使用的細胞株包括人類纖維腫瘤細胞HT1080 細胞株、人類腎 臟組織上皮細胞293T 細胞株、小鼠黑色素腫瘤細胞 B16F10 細胞株、小鼠 肌肉纖維母細胞C2C12 細胞株、及人類子宮頸癌細胞 HeLa 細胞株等，皆 在DMEM 細胞培養液中培養，放置於 37℃ 5%CO₂培養箱中。當細胞密度 到達一定程度時，進行細胞繼代培養。

4.6.3 解凍細胞

實驗前先準備DMEM 細胞培養液，15mL 細胞離心管一支，25cm² 細 胞培養盤一個，置入無菌操作台中。自液態氮中取出細胞冷凍管，置入37℃

水浴槽中回溫，等待冷凍管中融解三分之二時，迅速將冷凍管移至無菌操 作台中，與5mL 的 DMEM 細胞培養液ㄧ同放入 15mL 細胞離心管中。置入 離心機中，平衡後低溫離心1200rpm 10 分鐘，再放回無菌操作台上。倒去 上清液，並加入5mL 的 DMEM 細胞培養液，迅速且均勻的將細胞沖散，

然後將包含細胞之培養液移至25 cm² 細胞培養盤中，放置於 37℃ 5%CO2

培養箱中培養。

4.6.4 細胞繼代培養

當細胞密度長到一定程度，如293T 細胞長到 50%滿的時候，進行細胞

繼代培養。實驗前先準備DMEM 細胞培養液、PBS、EDTA-Trypsin、15mL 細胞離心管一支、75cm²細胞培養盤一個，置入無菌操作台中。自37℃ 5%

CO₂培養箱中取出包含適當密度細胞的細胞培養盤，使用自動吸注器將細胞 培養盤中舊的細胞培養液吸出，由細胞培養盤側邊加入3mL PBS，以避免 細胞被沖起，輕微搖晃細胞培養盤使PBS 能完全的潤洗細胞培養盤底部的 細胞，再以自動吸注器將PBS 吸出。視細胞種類加入 1~3mL EDTA Trypsin 到細胞培養盤中，輕微搖晃細胞培養盤使EDTA Trypsin 可以完全與細胞作 用，然後視細胞種類置入37℃ 5% CO2培養箱中 3~15 分鐘。自培養箱中取 出已與EDTA Trypsin 充分反應，並與細胞培養盤分離之細胞，加入 5~10mL 的DMEM 細胞培養液將細胞沖起，利用自動吸注器將包含細胞的細胞培養 液吸到15ml 細胞離心管中，置入離心機中，平衡後低溫離心 1200rpm 10 分鐘，再放回無菌操作台上。倒去上清液，並加入適當量的DMEM 細胞培 養液，將迅速且均勻的將細胞沖散，然後將包含細胞之培養液移至75cm² 細胞培養盤中，放置於37℃ 5%CO2培養箱中培養。

4.6.5 冷凍細胞

實驗前先準備冷凍培養液、DMEM 細胞培養液、PBS、EDTA-Trypsin、

15mL 細胞離心管一支、細胞冷凍管數支置入無菌操作台中。另外準備細胞 計數所用的細胞染劑trypan blue 及血球計數盤。自 37℃ 5% CO₂培養箱中 取出包含適當密度細胞的細胞培養盤，使用自動吸注器將細胞培養盤中舊

的細胞培養液吸出，由細胞培養盤側邊加入3mL PBS，以避免細胞被沖起，

輕微搖晃細胞培養盤使PBS 能完全的潤洗細胞培養盤底部的細胞，再以自 動吸注器將PBS 吸出。視細胞種類加入 1~3mL EDTA Trypsin 到細胞培養 盤中，輕微搖晃細胞培養盤使EDTA Trypsin 可以完全與細胞作用，然後視 細胞種類置入37℃ 5% CO₂培養箱中3~15 分鐘。自培養箱中取出已與 EDTA Trypsin 充分反應，並與細胞培養盤分離之細胞，加入 5~10mL 的 DMEM 細胞培養液將細胞沖起，利用自動吸注器將包含細胞的細胞培養液 吸到15ml 細胞離心管中，記取細胞培養液的總體積。取出 50μL 含細胞的 細胞培養液，使用PBS 作兩次兩倍稀釋，取 75μL trypan blue 加入 4 倍稀釋 的細胞液並混合均勻，取20μL 混合液自血球計數盤 chamber 上方凹槽加 入，蓋上蓋玻片，於100 倍倒立顯微鏡下觀察，活細胞不染色，死細胞則 為藍色，計算存活細胞並換算總細胞量。同時，將包含細胞液的15ml 細胞 離心管，置入離心機中，平衡後低溫離心1200rpm 10 分鐘，再放回無菌操 作台上。倒去上清液，並加入適當體積低溫的冷凍培養液使，每mL 冷凍培 養液含有2×10⁶個細胞，將迅速且均勻的將細胞沖散。迅速將包含細胞的冷 凍培養液加入預先寫好日期、細胞種類、實驗操作者的冷凍管中，每管包 含2×10⁶個細胞。然後將冷凍管放置冷凍細胞盒移至-80℃冰箱中，放置隔 夜，然後在放入液態氮桶中保存。