第四章 材料與方法
4.2 DNA 純化
4.2.2 大量質體純化
實 驗 所 使 用 之 大 量 質 體 純 化 是 運 用 High-copy Plasmid Purification PC100 (波仕特, 台灣, 中華民國) 的實驗模組來進行大量質體的純化，實驗 所需藥品與流程如下：
Solution 1 (pH8.0) (含 RNase A) Solution 2
Solution 3（pH5.1）
N2 buffer N3 buffer N5 buffer Elution buffer Isopropanol 70% Alcohol
二次水 (已滅菌)
1. 將培養 16~18 小時的 100mL 菌液移至 250mL 高速離心瓶中中，離心 15 分鐘，8,000rpm，4℃，倒掉上清液，將高速離心瓶倒置於乾淨紙巾 上2 分鐘。
2. 加入 4ml S1 buffer，以振盪或微量吸注器將大腸菌沉澱打散。
3. 加入 4ml 的 S2 buffer，緩慢的上下倒轉混合 6-8 次，靜置在室溫 20-25℃下 2-3 分鐘，最多不超過 5 分鐘。注意不可震盪，否則可能導致 genome DNA 懸浮在溶液中。
4. 加入預先冷藏在 4℃ 4mL 的 S3 buffer，緩慢的上下倒轉混合 6-8 次 直到產生白色的凝結物，靜置在冰上5 分鐘。
5. 在 4℃下，以 12,000rpm 的速度離心 30 分鐘。
6. 用 2.5mL 的 N2 buffer 洗滌並平衡 column 內的 pH 值與離子強度，等 N2 buffer 完全滴完之後，才可以進行下個步驟。
7. 取上清液注入 column 中，等上清液完全滴完之後，才可以進行下個 步驟。
8. 用 10mL 的 N3 buffer 洗滌 column 以去除蛋白質及其它雜質。
9. 再用 10mL 的 N3 buffer 洗滌 column，等 N3 buffer 完全滴完之後，才 可以進行下個步驟。
10. 加入 5mL 的 N5 buffer 將 column 中的 plasmid DNA 洗提出來。
11. 將 5mL 洗提溶液，分裝至 1.5mL 的 eppendorf 中 (每一管 eppendorf 裝有 830μL 洗提溶液)，然後加入 700μL 異丙醇 (isopropanol)並混合均 勻, 靜置冰上 10 分鐘 (0℃)。
12. 以 13,000rpm 離心混合物 45 分鐘 (4℃)，倒掉上清液，注意別把 eppendorf 底部的 DNA 沉澱倒掉。
13. 每一管 eppendorf 加入 1mL 70%的酒精，凍進-20℃冰箱。
13. 當需要使用 plasmid DNA 時，拿一管 eppendorf，離心 13,000rpm 5 分鐘 (4℃)。
14. 倒掉上清液，短暫離心，用微量吸注器吸乾剩餘的酒精，打開蓋子 靜置5 分鐘等待酒精揮發。
15. 加入 20μl 的二次水溶解 DNA，使用 photometer 測量其 260/280 光 吸收值，記錄並保存於-20℃冰箱中。
4.2.3 酵素反應後 DNA 純化
實驗所使用之
DNA 純化
是運用Gene-SpinTM 1-4-3 DNA Extraction Kit (波仕特, 台灣, 中華民國) 的實驗模組來進行大量質體的純化，實驗所需藥 品與流程如下：Binding solution Washing solution 二次水 (已滅菌)
1. 將 PCR 產物或者其它經酵素反應後的 DNA 溶液放到乾淨的 eppendorf 中。
2. 當 PCR 產物或者其它經酵素反應後的 DNA 溶液體積小於或等於 100μL，加入 500μL 的 Binding solution，然後使用振盪混合均勻。當 PCR 產物或者其它經酵素反應後的DNA 溶液體積大於 100μL 時，加入五倍 體積的Binding solution，然後使用振盪混合均勻。
3. 將 spin column 放入 collection tube 中，然後將上一步驟的混合物注入 結合好的spin column 中，離心 13000rpm 1 分鐘。
4. 取下 collection tube 上的 spin column，倒掉 collection tube 中的離心 後的廢液，將spin column 裝回 collection tube 中，注入 700μL Washing solution 到 spin column，離心 13000rpm 30 秒。
5. 取下 collection tube 上的 spin column，倒掉 collection tube 中的離心 後的廢液，將spin column 裝回 collection tube 中，注入 700μL Washing solution 到 spin column，離心 13000rpm 30 秒。
6. 取下 collection tube 上的 spin column，倒掉 collection tube 中的離心 後的廢液，將spin column 裝回 collection tube 中，離心 13000rpm 五分 鐘，以去除留在spin column 的殘留液體。
7. 將 spin column 裝在一個乾淨的 eppendorf 上，打開蓋子，置於 37℃
乾浴槽上5 分鐘，蒸發殘餘的酒精。
8. 加入 50μL 二次水到 spin column 中，
DNA
大小若大於7kb，則加入 預熱過的60℃二次水，靜置一分鐘。9. 將裝置於 eppendorf 上的 spin column 放到離心機中並平衡，離心 13000rpm 1 分鐘，將丟棄 eppendorf 上的 spin column。
10. 取 eppendorf 中的溶液，使用 photometer 測量其 260/280 光吸收值，
記錄並保存於-20℃冰箱中。
4.3 酵素催化反應 4.3.1 限制酶切割反應
實驗中所使用的限制酶購自 Fermentaus、NEB、Promega。根據不同實 驗目的進行不同量的限制酶切割反應。
當進行檢驗質體是否正確、基因是否正確的插入質體時，則進行小量的 限制酶切割反應：
取一0.2mL 微量離心管，加入適當體積滅菌的二次水，2.0μL 之 10×限 制酶切割反應緩衝液，BSA 0.2μL (50 mg/mL)，1μg 之 DNA，用滅菌的 二次水將體積補足至 19.5μL，最後加入 0.5μL 之限制酶 (10U/μL)，反 應總體積為20μl。使用振盪混合，短暫離心後置於適當反應溫度 (通常 是 37℃)之水浴槽中作用 2 小時，而後迅速置於冰上。該反應產物以 2
％洋菜膠體電泳進行分析。
當進行質體構築等需大量經限制酶切割反應完全之DNA 時，則進行大 量的限制酶切割反應：
取一 0.2mL 微量離心管，加入適當體積滅菌的二次水，10.0μL 之 10×
限制酶切割反應緩衝液，BSA 1.0μL (50 mg/mL)，5~10μg 之 DNA，用 滅菌的二次水將體積補足至 90~95μL，最後加入 5~10μL 之限制酶 (10U/μL)，反應總體積為 100μl。使用振盪混合，短暫離心後置於適當 反應溫度 (通常是 37℃)之水浴槽中作用 16 小時，而後迅速置於冰上，
接著進行
酵素反應後 DNA 純化
。純化完後進行之後的實驗，或者存放於4℃冰箱準備進行之後的實驗。
4.3.2 PCR
PCR 分為兩個部份，一個是引子設計的部份，一個是 PCR 設計的部份。
在引子設計的部份要注意下列幾點：
1. 引子序列中注意是否需要 ATG 序列或者 Stop codon。
2. 引子中要包含大約 50％的 GC，如果 AT 大於 50％的話，需較低的溫 度才能使引子與模版結合。而引子與模版結合的溫度我們稱之為 Tm 值，這個值並不是不變的，根據不同的化學環境如鹽度不同以及引子序 列排列方式及各種核甘酸的組成不同而有變化，理想Tm 值設計在接近 55℃。Tm 可以藉由一些軟體如 Invitrogen 的 Vector NTI 裡面的功能來 推估，也可以使用以下公式粗估：
Tm = 4 × (G+C) + 2 × (A+T)
3. 以下是使用不同 DNA 聚合酶 PCR 時，配合引子長度序列，大約推 估的PCR 時引子與模版黏合的溫度：
For Taq Tm － 7= 引子與模版黏合的溫度 For Vent Tm － 5= 引子與模版黏合的溫度
4. 引子長度設計應該在 20~25 bp 左右是比較恰當的 (不包含外加的序 列如限制酶切割位)
5. 引子內序列注意不要有迴文。
6. 引子的 3’端不要 G or C 以避免在 PCR 的時候引子之間提早開始黏 附，造成非專一性的PCR 產物。
7. 進行點突變引子設計時，突變的點應該要設計在 5’端而不要設計在 引子的3’端，以避免 PCR 失敗。
8. 在引子 5’端所設計的限制酶切割位必須在最外端添加 4bp 的隨機核 甘酸，以避免限制酶的內切酶特性而使得限制酶切割反應失敗或者不完 全。
在PCR 設計的部份，有幾個比較應該注意的部份，以下分點說明：
1. PCR 是由 denature-annealing-extension 三個步驟重複而產生。使用 Mastercycler Autorisierter thermocycler 提供溫度的變化：95℃使得模板 DNA 雙股分離 (denature)，然後降溫到適當的溫度 (通常是 55℃)，使 引子能夠與模版DNA 結合 (annealing)，接著將溫度提升到熱穩定 DNA 聚 合 酶 反 應 適 合 的 溫 度 ( 通 常 是 72℃) 進 行 DNA 聚 合 反 應 (extension)，然後又回到 95℃ denature 進到下一個循環。
2. PCR 中引子能夠與模版 DNA 結合 (annealing)的溫度是影響整個反應 好壞的關鍵步驟。當整個 PCR 反應沒有產生任何產物時，除了確認各 個反應物有沒有加錯以及酵素有沒有壞掉以外，失敗原因可能是因為調 整的 annealing 太高而造成引子沒有與模版結合，使得整個實驗沒有產 物出現，因此降低實驗 annealing 的溫度，也許就可以解決此一問題。
另外，annealing 溫度太低可能會造成引子與模版之間不專一性的黏合或
者引子之間不專一性的結合，而產生非專一性的 PCR 產物，此時可以 藉由提高annealing 溫度來減少非專一性的黏合。
3. 在使用熱穩定 DNA 聚合酶進行反應時應該注意其適合的反應溫度，
使用不適當的反應溫度可能會使得反應速度變差、失敗、出現非專一性 的PCR 產物或者更容易產生突變。
4. 不同的熱穩定 DNA 聚合酶的反應速度不同，以 Taq DNA 聚合酶而 言，其DNA 聚合反應一分鐘可以合成約 1kb DNA，相對的 DNA 聚合 酶pfu 每分鐘只能合成 600bp 左右，因此在 extension 時間要根據反應產 物的大小與所使用的熱穩定DNA 聚合酶決定。
5. 根據不同的使用用途去使用熱穩定 DNA 聚合酶，例如一般實驗室使 用PCR 的熱穩定 DNA 聚合酶是 Taq，因為其價格較便宜，也足夠應用 於一般實驗，但是如果需要比較高傳真低錯誤率的PCR，TaqDNA 聚合 酶平均每 500 bp 會出現一個突變可能就不能達到這樣的要求，此時具 有校正的熱穩定DNA 聚合酶 pfu 就可以取代 Taq，使用於對於低錯誤率 需求較高的實驗。但是一般而言，pfu 的價格較 Taq 更高，因此在質體 構築使用上，是運用pfu 來減少 PCR 反應實驗突變的機率，而在一般檢 測基因是否已經插入載體的PCR 則是使用 Taq 來完成。
6. 另外，適當的反應緩衝液也是使得 PCR 能夠成功的關鍵因素之ㄧ，
因為不同的離子強度、鹽度、pH 值會影響模板與引子的結合、酵素與 DNA 的結合，使用商品化實驗套組所附的 RCR 反應緩衝液，可以避免
因為RCR 反應緩衝液配製的誤差而得到不好的 RCR 反應。
實驗所使用之
PCR
是運用Pro Taq DNA Polymerase 實驗模組(波仕特, 台灣, 中華民國)與 pfu DNA Polymerase 實驗模組 (生工, 台灣, 中華民國) 來進行DNA 片段的增幅，實驗流程如下：取一0.2mL 微量離心管，加入適當體積滅菌的二次水，5.0μL 之 10×
PCR
反應緩衝液，dNTP 1.0μL (10mM)，5~10ng 之模版 DNA，兩股引子，用滅 菌的二次水將體積補足至49.5μL，最後加入 0.5μL 之 DNA 聚合酶
(5U/μL)，反應總體積為 50μl。使用振盪混合，短暫離心後置於 Mastercycler Autorisierter thermocycler 進行
PCR
，其反應循環順序為 94℃ 30 秒，55℃ 30 秒，72℃ 則根據使用的 DNA 聚合酶以及增幅片段大小決定，進行 34 個循 環增幅，最後以72℃ 5 分鐘將未完成之序列完成。而後迅速放置冰上，接 著進行洋菜膠體電泳確認產物大小是否正確。產物純化完成後進行接下來 的實驗，或者存放於4℃冰箱準備進行之後的實驗。4.3.3 Site-specific Mutagenesis by Overlap Extension
實驗所使用之
突變技術是運用
Site-directed mutagenesis of overlap extension，可分成兩個部份，一個是引子設計的部份，另一個是反應進行的 部份。在引子設計的部份，必須設計兩對引子，分別是將整段基因增幅出來的 第一對引子F2、R2，另一對引子則是在將要突變基因位置上互補的第二對
引子 FM、RM，其中 FM 與 RM 的互補區至少要有 15bp 完全互補，(圖十 六)，在設計並合成引子之後，接下來則是反應進行的部份。
Site-directed mutagenesis of overlap extension 的反應分成三個階段進行：
1)使用 FM 與 R2、RM 與 F2 的配對分別進行兩個 PCR 反應，增幅出兩個 突變的基因片段 FMR2、RMF2， 2) 再利用這兩個基因片段在突變位置上 的互補區域，分別當成彼此的引子進行延長反應 (Extension)，形成完整的
1)使用 FM 與 R2、RM 與 F2 的配對分別進行兩個 PCR 反應，增幅出兩個 突變的基因片段 FMR2、RMF2， 2) 再利用這兩個基因片段在突變位置上 的互補區域，分別當成彼此的引子進行延長反應 (Extension)，形成完整的