第四章 材料與方法
4.1 菌種的培養與轉型
實驗所用的菌種來源包括大腸桿菌ECOS 101 (益生生技, 台灣, 中華民 國) 與大腸桿菌 TOP10 (Invitrogen, Groningen, Netherlands)。其基因型分別 如下：
ECOS 101： F- (φ80d lacZΔM15)Δ(lacZYA-argF)U169 hsdR17(rk-- mk +) recA1 endA1 relA1 deoR λ- (類似 DH5 )
TOP10： F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 ΔlacΧ74 recA1 deoR araD139 Δ(ara-leu) 7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG
4.1.2 培養液與培養基的配置
以上兩種菌種都是使用 LB 培養基與 LB 培養液培養，實驗所用 LB 培 養液與LB 培養基製備方法如下：
Sodium chloride (NaCl) 10g Tryptone 10g Yeast extracts 5g
Agar 20g (LB 培養基需額外添加)
1. 秤重取出上列藥品，加入二次水約略到 900mL。
2. 搖晃讓所有粉末溶解。
3. 使用量筒精確量取體積，再用二次水將溶液總體積補到 1000mL。
4. 混合均勻並分裝到 500mL 或 1000mL 血清瓶中，分裝不可超過血清 瓶體積的80%。
5. 蓋上並旋轉瓶蓋到一半緊的狀態，再以錫箔紙覆蓋瓶蓋到瓶頸的部 份。
6.1. LB 培養液：貼上滅菌條，送到壓力鍋滅菌。滅菌完成後，鎖緊瓶 蓋。等到近於室溫時，放至4℃冰箱中保存。
6.2. LB 培養基：貼上滅菌條，送到壓力鍋滅菌。滅菌完成後，拿出並 搖晃混合均勻，置於65℃水浴槽中，使 LB 培養基溫度約等同於 65℃。
將 LB 培養基移至無菌操作台上，傾倒 10mL 的 LB 培養基到 LB 培養 基盤子上，等待冷卻後標上標簽，並放至4℃冰箱中保存。
7.1. 需要使用含抗生素之 LB 培養液，篩選含有特定種類質體的大腸菌 時，查詢適合的抗生素與其使用量 (附表)，在使用前添加並混合均勻並 分裝。
7.2. 需要使用含抗生素之 LB 培養基，篩選含有特定種類質體的大腸菌 時，查詢適合的抗生素與其使用量 (附表)，在 LB 培養基分裝到培養基 盤子前 (LB 培養基溫度應於 65℃以下以免抗生素失效)，加入適當量的 抗生素，混合均勻，將LB 培養基移至無菌操作台上，傾倒 10mL 的 LB 培養基到 LB 培養基盤子上，等待冷卻後標上標簽，並放至 4℃冰箱中 保存。
4.1.3 勝任細胞的製備
實驗所用的勝任細胞是以大腸桿菌ECOS 101 (益生生技, 台灣, 中華民 國)與大腸桿菌 TOP10 (Invitrogen, Groningen, Netherlands)為原始菌種的熱 震盪勝任細胞，製備所需藥品與方法如下：
LB 培養液 (不含抗生素) LB 培養基 (不含抗生素)
0.1M Calcium chloride (CaCl2) filtered with 0.2μm filter
0.1M Calcium chloride (CaCl2) contain 10％ Glycerol filtered with 0.2μm filter
Amp LB 培養基 (含 Ampicillin 50ug/mL)
1. 取出原始菌種菌液於 LB 培養基上做三方向塗盤，培養 12 小時。
2. 挑出單一菌落並加入含有 3mL LB 培養液的養菌管中，置於 37 ℃培 養箱，以轉速225rpm 培養 12 小時。
3. 取出 1mL 菌液，加入含有 100mL LB 的錐形瓶中，繼續培養 1 至 2 小時，一小時過後應每十五分鐘量一次OD600。
4. 預冷離心機使其溫度維持在 4℃，準備冰水共存 (0℃)之冰桶，將兩 只 50mL 無菌離心管及新鮮配製的 0.1M CaCl2 100mL、包含 10％
Glycerol 的 0.1M CaCl2 10mL 放置於冰桶中，使之維持在 0℃。
5. 取 1mL 培養 1 至 2 小時的菌液，並測量其 OD600 數值，當其數值為 0.35~0.45 時進行下面步驟 (不可大於此值)。
6. 分裝菌液至預冷的 50mL 無菌離心管中，置於冰水共存 (0℃)之冰桶 中10 分鐘。
7. 將菌液以 4100 rpm 的速度離心 10 分鐘 (4℃)。
8. 倒掉上清液，並倒置離心管 30 秒，馬上放置離心管於冰桶中。
9. 加入 0.1M CaCl2 30 ml (0℃) 於離心管中，使用 1mL 微量吸注器溫和 的沖散大腸菌沉澱。
10. 將菌液以 4100 rpm 的速度離心 10 分鐘 (4℃)。
11. 倒掉上清液，並倒置離心管 30 秒，馬上放置離心管於冰桶中。
12. 加入包含 10％ Glycerol 的 0.1M CaCl2 (0℃) 2mL 到離心管中，使用 1mL 微量吸注器溫和的沖散大腸菌沉澱。
13. 以每一管 100μL 勝任細胞分裝到 1.5mL 的 eppendorf 中 (0℃)，迅速 分裝完後，立刻置入-80℃冰箱中。
14. 經過 12 小時後，自-80℃冰箱中取出兩管勝任細胞進行轉型實驗，其 中一管加入質體pUC19 進行勝任細胞轉型，測試勝任細胞的效率；
另一管則不加入任何質體，確認勝任細胞製備過程中是否有污染。
取轉型後勝任細胞100μL 菌液，於 Amp LB 培養基上進行塗盤，確 認勝任細胞效率與污染情況。
15. 實驗所用勝任細胞為無污染且效率達 5×106/μg pUC19 之勝任細胞。
4.1.4 勝任細胞的質體轉型
實驗所用勝任細胞轉型的方法是熱震盪式轉型，實驗所需藥品與流程如 下：
LB 培養液 (不含抗生素) 含抗生素之LB 培養基
1. 自 -80℃冰箱取出勝任細胞，放置冰上溶解 5 分鐘。
2. 加入 5μL 的接合酶接合反應的產物，或者 1μL 1ng/μL 的質體到勝任 細胞中，稍微輕彈使之混合均勻。
3. 立刻放置勝任細胞冰上 30 分鐘。
4. 移動勝任細胞至 42℃的水浴槽中 2 分鐘，進行熱震盪 heat-shock 轉 型反應。
5. 迅速將勝任細胞置回冰上 2 分鐘。
6. 加入 LB 培養液 250μL (4℃)，移至 37℃的培養箱中，以轉速 225rpm 搖晃培養30~50 分鐘。同時放置含抗生素之 LB 培養基於 37℃的培養箱 中回溫。
7. 取 100μL 的菌液均勻塗布在含抗生素之 LB 培養基上，再置回 37℃
的培養箱中培養12 小時。