第五章 結果
5.9 表現其它胜肽片段之 AAV 對不同種細胞株的感染效率
為了瞭解所設計的胜肽導引式基因治療系統是否可以藉由RGD motif 以外的其他胜肽，改變其感染的能力，因此使用質體pAAV-m2RC-TP.
A549、pAAV-m2RC-C2C12 12.51、pAAV-m2RC-GE11、pAAV-m2RC-RG2 P2L 取代pAAV-RC，對 293T 細胞株進行三質體共同轉染，生產病毒並收集上
清液，對293T 細胞進行感染實驗，實驗中各別以質體 pAAV-RC 及
pAAV-m2RC 進行三質體共同轉染所生產出的病毒上清液為控制組，以病毒 所攜帶之hrGFP 基因當作報導基因，使用流式細胞儀偵測螢光細胞比例，
計算感染效率，(圖三十四)。
第六章 討論
本研究是運用Site-directed mutagenesis 的方式，在 AAV2 的病毒結構蛋 白次單元 (VPs) 上產生突變，使其失去對於細胞表面的主要受體 HSPG 結 合的能力。
過去的研究提出，AAV2 感染細胞時有七個主要的步驟，包括 1) 病毒 與細胞的結合、2) 穿越細胞膜、3) 形成的 endosome 在細胞運輸、4) 脫離 endosome、5) 移動到細胞核、6) 除去病毒外殼、7) 雙股 DNA 的形成，而 影響不同血清型AAV 感染細胞效率的關鍵則是在細胞表面是否提供適合的 受體與AAV 做結合。存在於多種組織細胞上的 HSPG 是 AAV2 與細胞黏附 的主要受體，提供AAV2 廣泛感染哺乳類細胞的特性。然而以作為基因治 療載體的角度來看，無法專一性的將基因遞送到適合的細胞將會導致許多 副作用。
過去對於VPs 突變的研究中發現，位於病毒結構蛋白第 487 號、第 509 號、第585 號及第 588 號鹼性胺基酸是影響 AAV2 與 Heparin 結合以及經由 HSPG 感染細胞的主要胺基酸。比對蛋白質序列，VPs 中的 VP3 的原子結 構、以及AAV2 的立體結構可以看出，這些影響 AAV2 與 Heparin 結合的鹼 性胺基酸，是位於VP3 外圍結構的 Loop 以及 AAV2 病毒外殼表面的突起，
具有直接與Heparin 作用的可能。研究者使用辨識這些鹼性胺基酸附近序列 的抗體，對AAV2 做抗體中和實驗，更直接證明位於病毒結構蛋白第 487
號、第509 號、第 585 號及第 588 號鹼性胺基酸是與 Heparin 直接作用的胺 基酸，提供AAV2 與細胞表面的 HSPG 結合的能力。
為了去除AAV2 不專一性的感染能力，因此以病毒結構蛋白第 585 號及 第588 號胺基酸當作突變對象，運用 Site-directed mutagenesis 將病毒結構蛋 白基因上的精胺酸的基因序列突變為丙胺酸的基因序列。
在感染人類纖維腫瘤細胞HT1080 細胞株、人類腎臟組織上皮細胞 293T 細胞株的實驗中發現，以質體pAAV-m2RC 提供病毒外殼基因，所得到的 AAV 上清液無法有效率的感染 HT1080 細胞株及 293T 細胞株，而野生型的 AAV 對於此兩種細胞株則有良好的感染能力。推論由質體 pAAV-m2RC 提 供病毒外殼基因所生產的AAV 失去其感染天然宿主的能力，可能是由於 heparin binding site 的突變而失去與其天然宿主細胞表面的 HSPG 結合的能 力，但仍有可能是因為病毒結構蛋白基因的突變，而使得AAV 無法有效率 的形成，或者產生不包含基因組的空病毒。在AAV 無法有效率的形成的部 份，可以藉由AAV 顆粒專一性抗體 A20 進行 dot blotting 及 ELISA 檢測 AAV 顆粒是否存在，並以AAV 結構蛋白專一性抗體 B1 進行 immuno-blotting 的 實驗，確認病毒結構蛋白的存在。在檢驗產生的病毒是否包含基因組方面，
過去的研究使用CsCl 等梯度離心，可以分離包含基因組的病毒與不含基因 組的病毒，也可使用260/280 光吸收值的不同，計算出不含基因組的空病毒 的百分比。
由質體pAAV-m2RC-RGD 提供病毒結構蛋白的 AAV 在實驗中，傾向於
專一性感染B16F10 細胞，對於其它種類細胞如 HT1080 細胞及 293T 細胞，
感染能力遠低於野生型AAV (30%~40%)。然而在 B16F10 的感染實驗中，
含有RGD motif 的 AAV 較野生型 AAV 有更佳的感染能力。這樣的實驗結 果，證明在AAV 上的 RGD motif 具有改變 AAV 感染細胞的能力，而過去 的研究中，於病毒結構蛋白的第587 號胺基酸後插入包含 RGD motif 基因 的L14 胜肽，也確實能夠使 AAV 感染 B16F10 細胞。這樣的實驗結果ㄧ方 面驗證過去的研究，ㄧ方面也可以確認所設計的質體DNA 提供的病毒結構 蛋白，不會破壞病毒結構而造成病毒組合與病毒基因包裹上的困難。雖然 如此，由於B16F10 細胞的感染效率大都在 10%以下，因實驗誤差而導致的 感染效率上的差距是要被審慎評估的。
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ON OFF ON OFF
治療用基因
基因傳遞系統
基因調節系統
1.病毒性基因治療載體 2.非病毒性基因治療載體 1.遺傳疾病基因
2.抑癌基因 3.神經病變基因 4.免疫調控基因
1.恆常性基因表現 2.可調節式基因表現
圖一，基因治療示意圖。基因治療由治療基因、基因調節系統、基因傳遞 系統三個部份所組成，根據不同的治療對象挑選適當的治療用基因，使用 不同的基因調節系統及基因傳遞系統，達成基因治療的目的。
圖二，PEI 的化學結構式 (節錄自 Godbey, W.T., Wu, K.K., A.G., PEI and its role in gene delivery, 1999, 60, 150)。
圖三，liposome 幫助 DNA 運送進入細胞。把 liposome 與 DNA 混合，使得 DNA 被包裹於其中，如此一來，DNA—liposome 複合物就可直接通過帶負 電性的細胞膜而送入細胞內。
圖四，AAV 的生活史。當沒有幫助病毒的存在下，AAV 在感染細胞後進入 潛伏期 (latent infection)，AAV 的 genomic DNA 專一性插入人類的基因組 中的特定位置上或者以游離基因 (episome) 的狀態存在於細胞中。
圖五，AAV2 的三維立體結構圖 (節錄自 Xie et al. 2002)。如圖所示，AAV2 的形態是接近圓球狀，並且以T=1 的正二十面體對稱。
圖六，不包含基因組之AAV2的立體結構模擬圖 (節錄自Stephanie
Kronenberg et al. 2001)，A、C、E圖分別代表病毒表面的形態、三倍對稱軸、
五倍對稱軸上結構的分佈。B、D、F圖則代表病毒內部的形態、三倍對稱 軸、五倍對稱軸內結構的分佈。
圖七，AAV2 病毒結構蛋白原子結構圖 (節錄自 Xie et al. 2002)。病毒外殼 內面部份，由兩個 antiparallel β-sheet 所形成的β
jelly-roll-barrel 的結構。病毒的外殼表面部份，則由許多 loops 所形 成，佔整個結構蛋白三分之二的蛋白質序列。
圖八，AAV2 的基因圖譜。AAV2 的基因組 DNA 兩端由兩個 inverted terminal repeats (ITRs) 所包圍，中間包含著兩個大片段的 open reading frames
(ORFs)，分別是 rep gene 及 cap gene。
圖九，病毒結構蛋白比對圖。(節錄自 Florian Sonntag et al. 2006)。構成病 毒外殼的VP1、VP2、VP3 在 C 端擁有共同的胺基酸序列，不同的是在 N 端，VP1 比 VP2 多 137 個胺基酸序列，VP2 又比 VP3 多 65 個胺基酸序 列。VP1 的 N 端包含 parvoviral phospholipase A2 (pvPLA) 區域的蛋白質序 列，以及三個提供nuclear localization signals (NLS) 的鹼性胺基酸序列 (basic amino acid sequence elements, basic clusters, BCs)。
圖十，AAV 感染細胞流程圖 (節錄自 Jeffrey S. Bartlett et al. 2000)。在與細 胞表面的HSPG 結合之後，AAV 馬上藉由 integrin αv/β5 參與的
clathrin-coated pits 被送到細胞內並形成 endosome。利用細胞內的細胞骨架 將endosome 輸送到細胞核附近區域，接著因為 endosome 內環境 pH 值下 降，導致AAV 的構形改變，而能夠脫離 endosome。聚集在細胞核附近的 AAV 可以藉由通過 nucleus pore complex 以外的方式進入細胞核並完成病毒 的感染。
圖十一，AAV2 病毒結構蛋白原子結構圖 (自 PBD 取得 AAV2 VP3 蛋白資 料1LP3，使用 NCBI 網站所提供的軟體 Cn3D 運算出結果)。於病毒結構蛋 白的 Heparin binding site 所在的序列 RGNR 圈選並標記，可以在結構圖 上看到一段變成黃色的 loop，比對圖七，可以知道此段 loop 是位於病毒的 三倍對稱軸上，是構成 AAV 表面三倍對稱軸附近的突起部份。
圖十二，AAV 感染細胞機制圖。
腺相關病毒文獻累積圖
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
1980 1990 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005
圖十三，歷年 AAV 相關文獻累積圖。
圖十四，使用 trans-splicing 方法使 AAV 可以攜帶更大容量之基因(節錄自 Yan Z et al. 2000)。