前在 Xylella 這一屬中仍然僅有 1 個種 X. fastidiosa，最近有些學者提出將 X.
fastidiosa 區分 5 個副種 (subspecies) 分別為 fastidiosa, multiplex, pauca, sandyi, 與 tashke (Hernandez-Martinez et al., 2007; Randall et al., 2009; Schaad et al., 2004)，Xyl. fastidiosa subsp. fastidiosa 含有菌系寄主來源為葡萄、杏仁、苜蓿及楓 樹，Xyl. fastidiosa subsp. Multiplex 含有菌系寄主為桃、李 (plum)、杏仁、榆樹 、 無花果 (sycamore) 及葡萄 (pigeon grape)，, Xyl. fastidiosa subsp. Pauca 含有菌系 寄 主 為 柑 桔 ， Xyl. fastidiosa subsp. sandyi 含 有 菌 系 寄 主 為 夾 竹 桃 、 忘 憂 草 (daylily)、藍花楹 (jacaranda) 及木蘭花 (magnolia) (Hernandez-Martinez et al., 2007)，Xyl. fastidiosa subsp. tashke 含有菌系寄主為一園藝景觀植物 (Chitalpa tashkentensis) (Randall et al., 2009)。
由於 16S rRNA 具有共通性 (原核或真核皆有核醣體核醣核酸)、演化速率 慢、高度保守性、提供足夠訊系等特點，16S rRNA 現已被大量使用於各式各式 各樣的微生物親緣訊息研究 (Hauben et al., 1997; Hillis & Dixon, 1991; Mehta &
Rosato, 2001; Stackebrandt & Goebel, 1994; Vandamm et al., 1996)。另外，許多微生 物的 16S rRNA 由於高度保守特性，基因序列相近造成在分類上有困難度。近年 來 學 者 改 以 基 因 序 列 變 異 度 較 大 的 16S-23S rRNA 區 間 序 列 (intergenic transcribed space, ITS) 來作為分類的研究 (Chen et al., 2004; Mehta & Rosato, 2001; Perez-Luz et al., 2004)。
為 了 解 台 灣 地 區 PD 葡 萄 罹 病 株 、 雜 草 寄 主 植 物 及 蟲 媒 所 感 染 之 X.
fastidiosa 菌株間親緣關係，進行 16S rRNA 序列與 16-23S rRNA 區間序列比對 分析，並引用文獻中 X. fastidiosa 不同植物寄主菌株比對 (Mehta & Rosato, 2001;
Su et al., 2011)，9 種寄主包含國內的梨以及及國外的葡萄、桑椹、李、核桃、無 花果、夾竹桃、咖啡及柑橘等，對照菌株為 Xanthomonas axonopodis pv. citri 菌株 (表 4)；基因體核酸抽取則參照 Sambrook 等人所建立的方法，測試菌株總量 DNA 則配製為 10 ng/μl 以供後續試驗；16S rRNA 序列分析採用引子對 16S-F (5’-AGAG TTTGATCCTGGCTCAG-3’) /16S-R (5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’)，PCR 反應 物條件及增幅條件參照 Chen 氏等人所設計條件進行 PCR 反應聚合 (Chen et
TTTTCGCCTTT CCCTC-3’），增幅條件則參照 Mehta 及 Rosato 所設計條件 (Mehta & Rosato, 2001)。PCR 反應所得 16S rRNA 及 16-23S rRNA 區間序列片 段經由純化後，以轉殖套件 pOSI-T PCR Cloning kit 來進行 DNA 片段之轉殖。
表4. 國內葡萄皮爾斯病菌與其他寄主植物 X. fastidiosa 菌株之來源
Table 4. Source of Xylella fastidiosa: Taiwanese Pierce’s disease strains and strains of other hosts
ND: not determined; US: unsubmitted to GenBank.
一步對照序列比對結果，我們可以發現來自國內的 PD 葡萄、雜草寄主及蟲媒白 邊大葉蟬菌系序列彼此間有 99-100% 相似度，與其他寄主的 X. fastidiosa 菌系 的序列比較皆有 98-99% 相似度，而與作為外群 Xanthomonas axonopodis pv.
citriu 比較有 95% 相似度 (表 5)。由 16S rRNA 序列親緣樹狀圖的樹型與距離 顯示：進一步由親緣樹狀圖可以發現 X. fastidiosa 不同地區寄主植物菌株可區分 五個菌群，第一群為葡萄與桑椹菌群；第二群為咖啡與柑橘菌群；第三群菌株包含 胡桃、李、桃及無花果菌群；第四群為夾竹桃菌群及第五群為梨菌群。而來自國內 PD 葡萄、雜草寄主及蟲媒菌系皆歸屬於 X. fastidiosa 菌群中的葡萄桑椹菌群 (圖 9)。
表5. 國內葡萄皮爾斯病菌與其他寄主植物 X. fastidiosa 菌株之 16S rRNA 序列 相似度比較
Table 5. Nucleotides similarities of 16S rRNA sequences of Xylella fastidiosa between Taiwanese Pierce’s disease strains and strains of other hosts
由於 16-23S rRNA 區間序列隨著演化過程會保留突變訊息，使得 16-23S rRNA 區間序列會有增長的現象，變異度也較高於 16S rRNA 序列。即使 16-23S rRNA 區間序列的片段約只有 511-540 bp，各序列長度上卻有 29 bp 的差別。國 內的 PD 葡萄、雜草寄主及蟲媒白邊大葉蟬菌系序列彼此間有 99-100% 相似 度，與其他寄主的 X. fastidiosa 的序列間比較有 97-100% 相似度，而與國內兩 個梨葉緣焦枯病菌株的序列以及作為外群 Xanthomonas axonopodis pv. Citri 的序 列比較只有 84-87% 及 77-78% 相似度 (表 6)。親緣樹狀圖與 16S rRNA 有一致 性的樹型，X. fastidiosa 不同地區寄主植物菌株亦可分為五個菌群。國內 PD 葡 萄、雜草寄主及蟲媒白邊大葉蟬菌系皆屬於 X. fastidiosa 菌群中的葡萄桑椹菌群 (圖 10)。由 16S rRNA 與 16-23S rRNA 區間序列親緣樹狀圖分析，國內各地 PD 葡萄、雜草寄主植物及白邊大葉蟬的菌株基因序列彼此間皆有 99-100% 相似度 具同源性。配合人工交互接種試驗結果亦顯示兩者可互相感染，更佐證國內 葡萄PD 發生罹病園鄰近有本土性蟲媒存在，而且可以藉由雜草寄主植物存在 而增加 PD 病害擴散的可能性。
表6. 國內葡萄皮爾斯病菌與其他寄主植物 X. fastidiosa 菌株之 16 -23S rRNA 序列相似值比較
Table 6. Nucleotides similarities of 16S-23S rRNA intergenic space sequence of Xylella fastidiosa between Taiwanese Pierce’s disease strains and strains of other hosts
結 論
國內 PD 病害已確認在 10 個鄉鎮之葡萄產區發生，田間觀察顯示栽
台灣應無法達到嚴重流行之條件；但 4 種雜草寄主雙輪瓜、漢氏山葡萄、
葎 草 及 野 桐 屬 白 匏 仔 陸 續 被 證 實 ， 文 獻 記 載 PD 病 害 之 病 原 菌 寄 主 範 圍 廣，涵蓋 28 科 94 種植物，而其中許多可能為無病徵寄主植物 (symptomless hosts），一般認為有些非作物寄主植物 (non-crop hosts) 可能為引起 PD 之
主要感染源，有潛能傳播病原至葡萄園，顯見國內葡萄產區 PD 病原菌有
可能藉由非作物寄主植物永續生存，依據歷年田間蟲媒偵測調查結果計有 4 種 木 質 部 取 食 者 昆 蟲 及 PD 罹 病 園 罹 病 植 株 分 布 與 鄰 近 偵 測 到 雜 草 寄
主似乎有地緣相關性，這些木質部取食者部分昆蟲種類初步證實為 PD 病
害自然傳播途徑角色；根據田間觀察通霄、外埔及后里 PD 嚴重發生葡萄
產區，農友多自行扦插繁殖葡萄植株，常發生扦插率低之情形及延遲萌芽 之 現 象 ， 甚 至 可 見 半 年 生 之 扦 插 植 株 罹 病 顯 現 典 型 系 統 性 葉 緣 焦 枯 之 病
徵，推斷 PD 可能早在當地危害多年？過去在人為扦插繁殖及不知情狀況
下移動罹病苗木傳播途徑確實會助長 PD 在該地區蔓延發生；目前國內葡 萄產區之大部分農友對本病之生態學基本資料仍不甚清楚？茲提幾點淺見 供國內葡萄 PD 防疫策略擬定之參考。
(一) PD 公告後應持需進行官方監控並有限度劃定疫區徹底執行相關防疫
措施，才能減緩 PD 對國內葡萄產業衝擊，維繫優質葡萄產業永續發
展。
(二) 在非 PD 疫區的葡萄產區，必需防範與管制自罹病的葡萄果園取用嫁接枝 條，以避免罹病枝穗、帶菌種苗植物及媒介昆蟲傳入產區。
(三) 透過農友講習會全面性宣導，讓農友完全清楚 PD 之生態學基本資料 及 葡 萄 產 業 衝 擊 之 嚴 重 性 ， 並 掌 握 住 適 當 之 調 查 時 機 及 田 間 診 斷 要
領，由農友自行標定園內 PD 之罹病株，自發性鏟除罹病株及周邊雜
草寄主植物，才能更有效撲滅國內葡萄產區 PD 之感染源。
(四) 未來積極防杜國外已知之蟲媒入侵，國內 PD 寄主範圍植物及本土性 之 蟲 媒 之 偵 測 調 查 應 持 續 進 行 並 深 入 探 討 兩 者 在 PD 流 行 病 學 所 扮 演角色。
誌 謝
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