基因安全性指標評估

安全性指標評估係指 KDS718 造成活體的基因毒性評估，基因毒 性試驗可分為體外(in vitro)與體內(in vivo)測試，其目的為偵測試驗 物質直接或間接引發的基因傷害及程度。多年來所研發及證實的基 因毒性試驗會因所使用的生物系統（體外(in vitro)與活體中的原核 生物（prokaryotic）、真核生物（eukaryotic））與所偵測的評估指 標（基因突變、染色體變異、DNA 損傷等等）不同而不同。由於沒 有任何單一試驗可偵測所有基因毒性之化學製品，所以應該採用涵 蓋不同目標與評估指標以及利用不同系統的一系列試驗，以預測試 驗物質的毒性傷害程度進而評估預測試驗物質所造成的基因毒性結 果。本篇所進行之基因毒性測試，包括：微生物基因突變分析：沙 門氏逆突變試驗(Ames revertant mutagenesis assay)、體外哺乳類細胞 基因毒性分析：鼷鼠淋巴瘤 tk 分析(in vitro mouse lymphoma tk revertant mutagenesis assay)及動物體內基因毒性分析：小鼠周邊血液 微核試驗(the micronuclei assay in the mouse peripheral blood)三大 類。

一、 沙門氏逆突變試驗

法。其原理是利用沙門氏菌(S. typhimurium)易受致突變物質作用，改 變其基因表現型，這些菌的histidine operon 基因序列上有各種不同層 次的突變，以致無法合成 histidine，所以其生長的培養基必須給予 histidine，否則無法存活。當致突變物與此菌同時共存下，可能會造 成 histidine operon 的突變，而恢復其合成 hisitidine 的能力，因此可 在沒有 histidine 的培養基內生長。這種現象是基因逆轉突變所造成 的，所以也可稱是基因逆轉突變試驗。沙門氏菌有不同的菌株，用以 檢測不同類型的致突變物。如菌株 TA100 或 TA1535，是在 hisG46 的密碼GAG (leucine)突變為 GGG (praline)，因而造成酵素活性喪失;

TA98 或 TA1538 是 his D 一個-1 的 frameshift 的突變，其前有 8 個 GC 重覆的序列，當致突變物引起一個鹼基的插入或二個鹼基的剔 除，則可恢復其正常密碼的排序; TA97 或 TA1537 則是加入一個鹼基 的+1 frameshift 的突變。所以 TA100 或 TA1535 菌株是用以偵測鹼基 取代的突變(base substitution); 而 TA1537， TA1538 及 TA98 菌株是 用以偵測鹼基移動的突變(base frameshift)。TA100 與 TA98 分別是由 TA1535 與 TA1538 菌株，經放入ㄧ個抗抗生素的 R-factor 所形成的，

可有效提升其偵測致突變物的靈敏度。

外來化合物(xenobiotics)進入人体後，通常會經由特定的酵素系統 進行代謝(biotransformation)，進而排泄至体外，大多數致突變物質也

會經由此系統代謝，但常會因此活化致突變物，使其具備致突變能 力。由於細菌系統缺乏此酵素系統，所以實驗中會加入S9。S9 是由 肝細胞的微小体(microsome)組成，具有代謝外來化合物的酵素系統。

二、 體外鼷鼠淋巴瘤tk 分析

L5178Y（鼷鼠淋巴瘤細胞）、TK6 和 WTK1 細胞（人類淋巴母 細胞）可能出現三種不同的基因型：tk+/+，tk+/-和 tk-/-。由 tk+/+突 變為是隱性突變，該突變不被表達，不出現突變表型，而由 tk+/-突變為tk-/-的突變，由於產生了同合子，突變表型得以表達，利用選 擇劑可以檢測出突變體。人類的 TK 基因定位於 17 號染色體長臂遠 端；在小鼠則定位於11 號染色體。TK 基因的產物胸苷激酶（thymidine kinase, TK），該酶利用胸苷（thymidine）或其類似物如三氟胸苷 (trifluorothymidine， TFT)合成核苷酸，最終合成 DNA。對於 TK 基 因功能正常的 tk+/-細胞，當給以外源性 TFT 時，因其結構與胸苷結 構相似，被胸苷激酶磷酸化而摻入到 DNA 中，破壞了 DNA 的正常 結構和功能，導致細胞死亡。tk+/-發生突變後變成純合子 tk-/-，導致 胸苷激酶缺陷，使 TFT 不能磷酸化，就無法參與合成 DNA，在含 TFT 的選擇性培養基中，tk-/-突變體細胞繼續存活而被檢出。利用此 模式，在細胞接觸化合物前後 tk+/-突變頻率的變化可檢測此化合物

是否為致突變物。

三、 小鼠周邊血液微核試驗

活體齧齒動物的紅血球微核（micronucleus, MN）試驗被廣泛地運 用在研究中，同時，也是評估化學與物理藥劑導致染色體損傷潛在性 的控管性安全評估方法。微核(micronuclei)是細胞核膜衍生出來的小 細胞核，通常是DAN 雙股斷裂（DNA double-strand Break）或異常 有絲分裂紡錘體（mitotic spindle apparatus），在細胞進行分裂時，無 法隨染色体中心粒分配到子細胞，所遺留下來的產物。所以微核試驗 是在測量染色体是否受到藥物作用而斷裂〔86-88〕。基本上它與染色 体斷裂試驗(chromosomal aberration assays， aneuploidy)所要觀察的 現象是雷同的，只是染色体斷裂試驗的分析方法比較繁瑣、比較費 時。所以我們將採用微核試驗來評估KDS718 是否會造成實驗動物細 胞染色体的斷裂。一般實驗動物給予藥物後，可由 rat 骨髓細胞或 mice 週邊血液細胞來觀察微核。小鼠正常成熟的紅血球沒有細胞 核，若成熟過程中染色体斷裂，會形成多核紅血球(polychromatic erythrocytes)，可視為有微核產生，並且它不會被腎臟清除，所以可 容易在週邊血液內找到。微核產生使紅血球無法成熟，其細胞內保有 較多的 RNA，形成所謂的網狀紅血球(reticulocytes)，可使用 Giemsa

stain 把含有 RNA 的紅血球染成藍色，正常紅血球為紅或粉紅色。

CD71 稱為轉鐵蛋白受體(transferrin receptor)，它是表現在分裂的 細 胞 與 腦 內 皮 細 胞 的 一 種 膜 糖 蛋 白 質 （ membrane-bound glycoprotein）。CD71 的生理功能是結合血清鐵轉鐵蛋白透過內吞作 用（endocytosis）來將鐵質轉入細胞內。由於 CD71 在網狀紅血球變 成熟而成為正染紅血球時會從網狀紅血球的細胞表面流失，所以對於 此受體的螢光抗體（fluorescent antibodies）：CD71-FITC 有助於以不 同染色來區分網狀紅血球及成熟紅血球，所以就可依CD71 的表現程 度來評估網狀紅血球，以便針對老鼠周邊血液中基因毒物誘發性微核 進行測量〔89〕。